2020 Fiscal Year Research-status Report
象牙芽細胞のcAMP/Ca2+シグナルクロストークと象牙質形成機能連関
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19K10117
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| Research Institution | Tokyo Dental College |
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Principal Investigator |
木村 麻記 東京歯科大学, 歯学部, 講師 (90582346)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渋川 義幸 東京歯科大学, 歯学部, 教授 (30276969)
東川 明日香 東京歯科大学, 歯学部, 助教 (20822472) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 象牙芽細胞 / サイクリックAMP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は象牙芽細胞cAMPシグナルの機械刺激誘発性Ca2+シグナルと石灰化能に対する作用を生物物理・薬理学的に検討することで、細胞内cAMPの象牙質形成に対する作用を明らかにすることを目的としている。2020年度は象牙芽細胞における1）細胞膜Gタンパク質共役型受容体アゴニスト投与による細胞内cAMP動態、2）細胞内cAMP増加誘発性Ca2+流入の経路について検討した。
1）ラット急性単離象牙芽細胞において、Gsタンパク質共役型受容体であるカルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）受容体、パラトルモン（PTH）受容体、ニューロキニン1（NK1）受容体の発現とそれら受容体活性化による象牙芽細胞内cAMPシグナルを検討した。その結果、象牙芽細胞にCGRP受容体、PTH受容体、NK1受容体が発現しており、活性化で細胞内cAMPレベルが増加することが示唆された。加えて、CGRP受容体、PTH受容体活性化による細胞内cAMPレベル増加はアデニル酸シクラーゼの活性化で生じることが示唆された。
ヒト培養象牙芽細胞において、Giタンパク質共役型受容体であるP2Y12, 13受容体活性化による象牙芽細胞内cAMPシグナルを検討した。Gsタンパク質共役型受容体を活性化した状態でP2Y1,12,13受容体アゴニストを投与すると細胞内cAMPレベルは減少した。このことから象牙芽細胞に発現するP2Y1,12,13受容体にはGiタンパク質共役型受容体が含まれることが示唆された。
2）ヒト培養象牙芽細胞において、アデニル酸シクラーゼ活性化薬で誘発されたCa2+流入は機械感受性チャネルであるTRPV1チャネル、piezoチャネル、TRPV4チャネル、その他のCa2+チャネル、Na+-Ca2+交換体によるものではないことが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Giタンパク質共役型受容体活性化による細胞内cAMPレベルの減少を記録する実験手技の確立に時間がかかってしまい、Giタンパク質共役型受容体活性化による象牙芽細胞内cAMPシグナルの検討が思うように進まなかったため、進行状況としてはやや遅れている。現在はその実験手技は確立され、実験は進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度に引き続きアデニル酸シクラーゼ・Gタンパク質共役型受容体活性化による細胞内cAMP誘発性Ca2+シグナルを検討する。加えて、機械感受性チャネルに対する細胞内cAMPによる修飾作用と石灰化能に対するcAMPの作用の検討を行う。
1)アデニル酸シクラーゼ・Gタンパク質共役型受容体活性化による細胞内cAMP誘発性Ca2+シグナルの解明：2020年度までに細胞内cAMP増加誘発性Ca2+流入の経路が機械感受性チャネルであるTRPV1チャネル、TRPV4チャネル、piezoチャネルではないことを明らかにした。今後は他の機械感受性イオンチャネルであるTRPA1チャネルとcAMP増加で活性化されるcyclic nucleotide-gated（CNG）チャネルに着目し、細胞内cAMPレベルと細胞内Ca2+濃度の同時計測を行い、細胞内cAMP増加誘発性Ca2+流入の経路を明らかにする。
2)機械感受性チャネルに対する細胞内cAMPによる修飾作用：①cAMPが機械感受性チャネルの機械感受性を増強するか、②様々な強度の機械刺激を行った時の細胞内Ca2+濃度増加と細胞内cAMPレベル変化の刺激強度依存性を検討する。これらから1)機械刺激誘発性細胞内cAMPレベル増加を検討、2)cAMPの機械刺激誘発性Ca2+シグナルに対する増強作用を明らかにする。
3) 石灰化能に対するcAMPの作用：1)の検討で細胞内cAMP増加誘発性Ca2+流入経路として明らかになった細胞膜たんぱく質の象牙質石灰化作用と象牙質石灰化促進作用に対する修飾作用を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
Gタンパク質共役型受容体のアゴニストとアンタゴニスト投与時の応答を細胞内cAMPレベルと細胞内遊離Ca2+濃度を両方計測する予定であったが、再考した結果、細胞内cAMPレベルの計測で十分であることから高額なCa2+蛍光指示薬の購入が減ったため次年度使用額が生じた。2021年度はcAMPセンサー、Ca2+蛍光指示薬、各種アゴニスト・アンタゴニスト、免疫染色に用いる抗体などを使用するため、次年度使用額はそれらの試薬代として使用する予定である。
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