2019 Fiscal Year Research-status Report

Effect of new antimicrobial photodynamic therapy system on biofilm inhibition

Research Project

Project/Area Number	19K10140
Research Institution	Aichi Gakuin University
Principal Investigator	林潤一郎愛知学院大学, 歯学部, 講師 (30350937)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	福田光男愛知学院大学, 歯学部, 教授 (40156790) 長谷川義明愛知学院大学, 歯学部, 教授 (70460524)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	抗菌光線力学療法 / バイオフィルム / インドシアニングリーン / 歯周病原細菌 / 緑膿菌
Outline of Annual Research Achievements	申請者らの研究室では、歯周病の新たな治療法として抗菌光線力学療法(aPDT)に着目し研究開発を行なってきた。独自に開発した光感受性物質であるICG-Nano/cを用いたaPDTシステムは浮遊性の歯周病原細菌に対し高い殺菌作用を示している。歯周病は口腔内の代表的なバイオフィルム感染症であり、バイオフィルムの抑制が重要であるため、本研究では、このaPDTシステムの歯周病バイオフィルムの抑制効果を確認する計画である。 2019年度は、まず歯周病原菌のバイオフィルムへの効果を確認した。深底の９６穴プレートの角ウェルに血液感電培地を注入し、その上にTSB液体培地を載せて、Porphyromonas gingivalis ATCC33277株の培養を行った。37度4日間の嫌気培養を行い、その後培養上清を除去し、バイオフィルムを作製した。バイオフィルムを形成した寒天培地状に、ICG-Nano/cの懸濁液を注入し、レーザー照射を行ったところ、70％の殺菌効果を認めた。また、擬似歯肉としての３mm厚の牛肉片を透過したレーザーによっても、同様の殺菌効果を認めた。これにより、ICG-Nano/cを用いたaPDTシステムは直接的なレーザー照射や歯肉を透過してのレーザー照射の両方において、バイオフィルムに対する殺菌効果があることが示唆された。しかし、上記のバイオフィルム作製法では、バイオフィルムの性状分析が困難なため、新規の方法を試みた。対数増殖期まで培養したP. gingivalis菌液を適宜菌数調整し、スライドガラスに装着した培養用シリコン枠に注入後、嫌気状態で数日間培養しバイオフィルムを作製した。Live/Dead試薬にてバイオフィルム内の細菌の生死をレーザー顕微鏡にて確認したところ、培養7日目で生菌数が最大になった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason P.gingivalisでの結果に再現性がとれない、顕微鏡での観察がうまくいかないなど、新しい方法でのバイオフィルム作製が順調にいかず、時間がかかっている。また、他の業務の影響により、本研究に割り当てられるエフォートが少なくなっており、予定して順調に研究が進められていない。さらに年度末において、新型コロナウィルスによる出勤制限の影響で実験の機会自体が得られていないことも、大きく影響していると考えている。
Strategy for Future Research Activity	P. gingiivarisのバイオフィルムについては、今後、性状解析を行っていく予定である。性状解析については、走査型電子顕微鏡での表面性状の形態確認、生菌／死菌比率の測定、共焦点型レーザー蛍光顕微鏡による厚み計測をおこなう予定である。また、バイオフィルムへのICG-Nano/cの浸透度の測定も行う。また、S.gordoniiのバイオフィルムでも同様な検討を行う予定である。歯周病関連の細菌以外の細菌としてはPseudominas aeruginoza のバイオフィルムも作成していく。単独菌での解析が終了したのち、P.gingivalisとS.gordoniiを共培養させたバイオフィルムを作製し、解析を行っていく予定である。 aPDT効果については、まず、歯周ポケット内でのレーザー照射や表在性のバイオフィルムへの直接照射を想定した実験方法にて殺菌効果を確認する。次に、歯周ポケット外部からのレーザー照射など組織下の病巣への外部照射を想定した実験方法にて殺菌効果を確認する。また、バイオフィルム関連遺伝子発現に対するICG-Nano/cを用いたaPDTの影響それぞれのバイオフィルムで、致死レベル以下のエネルギー照射によるaPDTを行い、バイオフィルム形成に関わる各種遺伝子の発現を調べる。解析の対象とする遺伝子:gtfB（EPSの不溶性グルカン産生に関連）、luxS（細胞間情報伝達に関連）gloEL、dnaK（ストレス応答タンパク）などを計画している。
Causes of Carryover	研究の進捗がおくれており、研究分担者による使用もなかったため、助成金の使用が減少した。また、購入予定であった備品も年度内の購入に至らなかったことから、使用額が少なくなった。今後の使用計画としては、まず備品の購入で25万円、細菌培養関連の消耗品で40万円、ナノ粒子作製関連の消耗品で50万円、レーザー顕微鏡関連消耗品で40万円、その他消耗品で30万円、旅費等で15万円で200万円前後の使用を予定している。