2022 Fiscal Year Research-status Report
Effect of new antimicrobial photodynamic therapy system on biofilm inhibition
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19K10140
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| Research Institution | Aichi Gakuin University |
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Principal Investigator |
林 潤一郎 愛知学院大学, 歯学部, 准教授 (30350937)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福田 光男 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (40156790)
長谷川 義明 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (70460524)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 抗菌光線力学療法 / バイオフィルム / インドシアニングリーン / 歯周病原細菌 / ナノ粒子 / 歯肉外部照射法 / 酸化ストレス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者らは、これまでインドシアニングリーンと半導体レーザーを用いた、歯周病に対する抗菌光線力学療法(aPDT)の研究を行ってきた。インドシアニングリーンを単独で光感受性物質として用いるのではなく、PLGAに封入してナノ粒子化してキトサンにてコーティングしたもの(ICGナノ粒子)を独自に開発し、その有用性の検討を行ってきた。また、半導体レーザーの波長特性を利用し、歯肉の外からレーザーを照射し、歯周ポケット内部までレーザーを届かせる外部照射法（歯肉外部照射法：transgingival irradiation）を考案し、その実効性を調査してきた。本研究課題では、我々のaPDTの方法が、バイオフィルムに対し効果を発揮するのかどうかを検討している。２０２２年度は、歯周病原細菌であるPorphyromonas ginivalis(Pg)のバイオフィルムをポリスチレンの培養皿上に作成し、ICGナノ粒子を用いたaPDTを行った。その結果、９７％が殺菌されることが判明した。またグラム陽性菌の代表であるStreptococcus gordonii(Sg)でも、同様にバイオフィルムを作成し、aPDT実験を行ったところ、PgよりもSgの方がaPDTの効果が低いという結果となった。
その後、Pg、Sgの2菌種の混合バイオフィルムの作成を試み、種々の条件を変えながら、培養を行った。しかし、その２菌株を組み合わせるとPgの発育が遅くなり、Sgのみが生育したバイオフィルムになってしまうなど、その作成は困難な状況が続いている。
最近になり、混合させる２菌の割り合い、それぞれの発育状況など、混合バイオフィルムに適した条件をみつけることができたので、今後は混合バイオフィルムでのaPDT殺菌効果を確認する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
新型コロナウィルス感染症対策のため、一部実験に支障をきたした。また２菌種混合のバイオフィルムの作成に時間がかかっており、そのため、研究の進捗が遅れている。混合バイオフィルムについては、培養条件をいくつか変えながら作成を試みており、安定して培養できる方法を模索している一方で、単独菌種のバイオフィルムについては、安定的に作成できているため、現在は外部照射モデルを用いたaPDTでの殺菌効果を確認している。
また、外部照射法の臨床研究を並行して行っており、それに人的時間的なリソースを割いており、それも本研究課題の進捗が遅れる理由の一つとなっている。外部照射法の臨床研究は、パイロット研究を終え論文の投稿準備中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず混合菌種のバイオフォルムを安定的に作成できるように、培養条件を変えながら適切なプロトコールを模索していく。バイオフィルムが安定して作成できるようになった後は、直接照射法、外部照射法それぞれの実験モデルにて、殺菌効果を確認する。併せて、バイオフォルムの性状分析として、生菌/死菌比率の測定、共焦点型レーザー顕微鏡による厚み測定等の試験を行う。
次に、aPDTの細菌への影響を、遺伝子発現の面から検討を加える。aPDTにおけるレーザー出力を抑えて、死滅しない程度のストレスを与え、各種遺伝子の発現を確認する。バイオフィルム関連遺伝子として、菌体外多糖の不溶性グルカン産生に関連するgtfB 、細胞間情報伝達に関連するluxS などを調べるとともにgloEL、dnaKなどのス トレス応答タンパク、SODなどの抗酸化機構にかかわる遺伝子などの発現状態を調べる。これらについては、それぞれ単独の浮遊細菌、単独バイオフィルム、混合バイオフィルムについて実験を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
研究の進捗が遅れており、物品の購入が予定より少なかった。また、学会発表や研究関連の出張はあったものの、今後の物品費購入、成果報告のための費用確保のため、旅費としての使用は行わなかった。
次年度の使用予定としては、細菌培養関連消耗品で１０万円、レーザー・aPDT関連消耗品、顕微鏡関連消耗品で１０万円、遺伝子発現解析関連消耗品で３０万円、その他消耗品で１０万円を計画している。論文作成経費で３０万円の支出を予定している。
細菌培養関連消耗品は血液寒天培地を中心に購入する。レーザー・aPDT関連では、ナノ粒子作成に関する費用が中心となる。また、顕微鏡関連では電子顕微鏡、生菌/死菌判定試薬等を購入する予定である。遺伝子発現関連は、リアルタイムPCRのプライマーや試薬等に使用する費用が多くなっている。最終的な論文執筆に関して、英文のオープンアクセスとして発表予定であるため、英文校正料、掲載料が経費として多くかかると想定している。
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