2019 Fiscal Year Research-status Report
Observation of cell movement after the implantation of mouse incisal apical bud cells to molars
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19K10162
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| Research Institution | Fukuoka Dental College |
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Principal Investigator |
坂上 竜資 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 教授 (50215612)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | apical bud / セメント質 / Hertwig上皮鞘 / Malassezの上皮遺残 / 上皮間葉転換 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、歯胚の上皮系細胞を移植して動態を追跡することで歯の発生と分化のメカニズムを解明し、再生療法の発展につなげることである。マウス切歯根尖には上皮系の幹細胞からなるapical budがあり、この働きにより生涯に亘って歯が伸び続ける。われわれは、GFP陽性トランスジェニックマウスの切歯apical bud細胞を採取後に分散化して、野生型マウス切歯に35ゲージ針にて注入する手技を開発した。申請計画では、GFP陽性マウス切歯のapical bud細胞を採取後に分散化して、野生型マウスの臼歯歯根膜腔と臼歯歯胚とに注入する。apical bud細胞は、エナメル芽細胞／Hertwig上皮鞘／Malassez残存上皮に分化するので、臼歯に移植した細胞の動態を観察することで歯の発生機構を解明し、さらに細胞を用いた歯周組織再生療法につながる知見が得られる可能性がある。
この１年間は、動物実験と組織切片作成のための最適条件決定に費やした。その結果、ノウハウを蓄積し、恒常的にapical bud を採取し移植することが可能となった。また、川本法による凍結切片作成を数多く行って、最もアーティファクトの少ない結果を得るための技術を蓄積した。
実験手技はほぼ完成したので、学会発表と論文投稿に必要なデータの採取をしているところである。これまでのところ、いくつかのサンプルで、GFP陽性の細胞（移植したアピカルバッド由来の細胞）が、セメント質内および周辺でオステオカルシン陽性の細胞として遊走しているところを確認した。セメント質内に取り込まれているだけなのか、上皮間葉転換を生じてセメント芽細胞に分化したのかは、さらに詳しく検証したいと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
実験を始めるに当たって、LEICA社製のクライオトームの機械のコンプレッサー不良から温度管理ができない状態が発覚した。このため、当研究予算と講座の研究費を集約して、新たにクライオトームを購入することを考えた。しかしその後、大学予算でこの機器を修理することとなり、現在は貸出機が暫間的に導入されている。何とか支障を生じずに、実験をすすめている。。
2019年度からは大学院生の高瀬稔君とともに、週に１日か２日のペースで順調に動物実験と資料作成を行っている。動物実験手法は、高瀬君も十分に習得し、apical budの採取に関しても、ほぼ8割くらいの確立で単離できるようになった。
実験計画は細部で少しずつ変更を加えながら、チューンアップを図っている。大きな計画変更点は（１）計画段階では、下顎臼歯部への移植を計画していたが、組織切片の作りやすさを考えて、現在は上顎臼歯部に変更している。（２）計画では３５ゲージの針を使って分散化した細胞を２μl移植するとしているが、現在はドリルで穴をあけてピペットで５μlを歯根膜腔に注入している。（３）岩手医科大学の原田先生のアドバイスにより、１次抗体にオステオカルシンを作用させている。（４）オルガネラを作成して移植する研究の第二段階にはまだ至っていない。
以上より、実験計画の進捗状況は概ね順調と考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
実験を遂行する上で障害となってきた事象については、その都度、試行錯誤を繰り返して解決してきている。凍結標本の作製に当たっては、川本法を応用している。これまで、切断面を前頭断方向としていたために、クオリティーの高い切片ができずに時間がかかった経緯がある。歯根部を横断方向で切断することで、エナメル質を含まない切片ができることが分かり、凍結切片の断裂が少なくなった。これにより、パラフィン包埋を用いずとも、凍結切片のHE染色と蛍光免疫染色のみで研究を完結できる目途が付いた。数か月以内には、当初の予定通りの研究成果を出せると考えている。
現在は、1次抗体にオステオカルシン、２次抗体にFluoro568を用いてGFPとの共局在を検証している。今後、当初の研究計画に入れていたpodopolanin、odam、amelogenin、vimentin、osteopontinなども試してみたいと考えている。
このテーマをメインテーマとしている大学院生の高瀬君の研究発表と論文作成を、できるだけ早期に図りたい。
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| Causes of Carryover |
今年度は、動物実験手技のチューンアップに多くの時間を費やした。さらにコントロールされた病理組織標本を作製するために、試行錯誤を重ねた。実験に費やした時間は週に10時間程度と多かったが、当初予定していた試薬の購入などは、この理由のために延期することとなってしまった。
実験に必要な１次抗体などの高額の消耗品は、次年度に買う予定としている。本年度はosteocalcinのみを購入したが、次年度は数種類の1次抗体を購入するので、今年度分の未使用予算は次年度に執行される予定である。
今年度からは、大学院生の高瀬稔君が新たな戦力として加わり、実験知識と技術の共有という側面でも安心して実験遂行ができるようになってきた。研究遂行にあたっては、2人で共同で同時進行ですすめることができるので、実験動物の消耗量も今後多くなってくるものと考えている。さらに、病理データが増えてくるとデータの蓄積と実験結果の整理のために、次年度は消耗品や整理のための機材が増えると考えており、今年度分の使わなかった予算が必要になる。
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