The study of bone matrix-derived TGF-beta that acts as a bone coupling factor

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K10176
• Research Institution: Tsurumi University
• Principal Investigator: 唐木田 丈夫 鶴見大学, 歯学部, 講師 (40367305)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山越 康雄 鶴見大学, 歯学部, 教授 (20182470) ; 山本 竜司 鶴見大学, 歯学部, 講師 (20410053) ; 斉藤 まり 鶴見大学, 歯学部, 助教 (60739332) ; 千葉 理紗子 鶴見大学, 歯学部, 学部助手 (50804887)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: TGF-β / 破骨細胞 / リモデリング / カップリング

Outline of Annual Research Achievements

生体では古い骨を破骨細胞が溶解し（骨吸収）その跡に骨芽細胞が新しい骨を作る（骨形成）リモデリングが行われている。正常な骨量を維持するためには、骨吸収と骨形成のバランスを保つカップリング機構が重要であり、それを調整する様々なカップリング因子が明らかにされつつある。本研究では骨基質中に大量に蓄えられているTGF-βに注目し、カップリング因子としての可能性を見出そうとしている。TGF-βは骨基質中では不活性な潜在型（LTGF-β）で存在し、骨吸収の際に破骨細胞から分泌される酸によって骨基質の溶解と共に放出・活性化される。これを再現するin vitroモデルを作製し、骨基質中のTGF-βが破骨細胞自身の活性にどのような働きをするか検討することにした。
本年度は細胞培養法を用いた骨吸収実験モデルの作製とその方法の妥当性の確認を行った。表面にLTGF-βを共有結合させた培養プレートの表面にヒドロキシアパタイト結晶(HA)をコーティングして模擬的な骨基質を作製した。この培養プレート上でマウスマクロファージ由来のRAW264細胞をリコンビナントRANKL存在下で培養すると2～3日で破骨細胞に分化し、破骨細胞から分泌される酸によってプレート表面のHAが溶けてピットが形成された。このプレート表面をEDTA溶液でHAを脱灰除去し、蛍光免疫染色法でプレート表面のLTGF-βを観察したところ、均等に蛍光発色しているプレート表面がピットを形成した部分だけ消失していた。この結果は骨吸収による骨基質中のTGF-βの放出が再現されていることを示している。また、LTGF-βを表面に結合させたプレートのピット面積は未処理のものと比べて大きかったことから、骨吸収によって放出されたTGF-βは破骨細胞の骨吸収活性を増強させることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は骨吸収実験モデルの作製と実験の妥当性を確認した。細胞の培養日数、破骨細胞分化を誘導するためのリコンビナントRANKLの濃度、プレート表面に共有結合で固定化する際のLTGF-βの濃度などプレート上に模擬骨基質を作製する最適条件を検討した。また、RANKLによる破骨細胞の分化と骨吸収活性は実験間でばらつきがあるため、安定してTGF-βの効果を判定できる条件を検討した。このモデルを使った実験は骨吸収活性がやや不安定であるものの、骨基質から放出・活性化されたTGF-βと破骨細胞の骨吸収能の間に正のフィードバック作用が示唆されるなど、本研究は概ね順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

今後の推進方策は以下の3点を予定している。①骨基質由来TGF-βの骨吸収促進作用のメカニズムを探るため、波状縁やアクチンリングなどの骨吸収に関連する破骨細胞の形態を観察し、酸分泌に関連する酵素やその遺伝子発現を測定する。②骨芽細胞を活性化する破骨細胞由来のサイトカインを測定することで、骨基質由来TGF-βの骨形成に対する間接的な作用を検討し、骨リモデリングにおけるTGF-βの総合的な働きを明らかにする。③実験的骨粗鬆症モデル動物の骨基質内のTGF-β濃度と骨密度を測定することで、骨粗鬆症における骨基質TGF-βの影響を検討する。