2019 Fiscal Year Research-status Report
ヒトiPS細胞からの生理機能を有した副甲状腺細胞分化誘導同法の開発と機能評価
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19K10179
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
中塚 隆介 関西医科大学, 医学部, 助教 (90454561)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | iPS細胞 / 副甲状腺 / 分化誘導 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多能性幹細胞から副甲状腺細胞の分化誘導については、現在のところ有効かつ確立された分化誘導法は未だに開発されていない。ヒトES細胞から副甲状腺ホルモン（PTH）を発現する副甲状腺細胞様の細胞の作製が報告されているが、細胞の機能評価等が十分にされておらず、その後も有効な分化誘導法についての報告も無い。そこで、ヒトiPS細胞を用い発生期の分化系譜に沿った形での新規誘導方法の開発を試みた。生体の発生において副甲状腺は胚体内胚葉（Definitive endoderm, DE）から前方前腸を介し、咽頭弓を経て形成される。また、胸腺は発生の起源を副甲状腺と同じくするため、胸腺の分化誘導法も参考として分化誘導法を立案した。分化誘導法は、副甲状腺の発生過程をもとに、1）Activin Aを含む分化誘導培地によるDEへの分化誘導 2）レチノイン酸を含む培地による咽頭弓細胞への誘導 3）ソニックヘッジホッグ（Shh）による副甲状腺分化を基軸とし、分化誘導効率を調整するために化合物などの添加や培養時間の調整を適宜行った。分化誘導後の細胞を用い、PCR、フローサイトメトリー、免疫蛍光染色などの解析を行い、副甲状腺細胞への分化誘導を評価した。また、培養上清中のPTH産生をwhole PTH、インタクトPTHそれぞれについて測定した。その結果、DEや咽頭弓の分化段階において発現するマーカー（CXCR4, EpCAMなど）を確認することができた。最終分化段階においては、PTH, カルシウム受容体とともに副甲状腺分化において重要とされる転写因子GCM2の発現が一部の分化誘導系においてみられた。しかしながら、培養上清中へのPTH産生については芳しい結果を得ることができなかった。以上より、現在の副甲状腺細胞誘導系ではiPS細胞からわずかに副甲状腺細胞を作成できるものの、効率は非常に低いと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
多能性幹細胞を用いた副甲状腺細胞分化誘導の開発については、ES細胞からの誘導が報告されているのみで、これらの論文についても十分な機能評価がなされているとは言い難い状況であった。今回、iPS細胞を用いた新たな副甲状腺細胞分化誘導法の開発にあたり発生過程を模倣する方法での分化誘導を行った。その結果、わずかながらPTHやカルシウム受容体など副甲状腺細胞特異的なマーカー遺伝子を発現する細胞が誘導により得られたと考えられた。一方、機能評価をするうえで重要な培養上清中へのPTH産生については十分な結果を得られていない。当初予定では分化誘導法の開発と機能評価を当該年度中に実施するとしていたが、分化誘導法の開発はおおむね順調に進んでいるものの機能評価をするに至っていない現状を鑑み、進捗の評価を「やや遅れている」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度同様、分化誘導法の開発、改良に取り組む。副甲状腺細胞分化効率を向上させるため、分化誘導法の途中ステージにおけるDEや咽頭弓への誘導効率向上をはかり、副甲状腺への効率の良い分化を目指す。（Differentiation 2016）や（Nat Biotechnol. 2011）で示された手技により、胸腺や副甲状腺の原器となる前方前腸内胚葉への確実な分化誘導を試みる。また、細胞の相互作用による自律的な分化誘導が効果的か確かめるため、浮遊培養系によるオルガノイド培養も試みる。培地中への添加による誘導法では副甲状腺への分化誘導効率があまり高くないことが示唆されたため、転写因子の強制発現による分化誘導法も検討する。具体的には、発生過程において咽頭弓から副甲状腺細胞へ分化する際重要とされるGCM2をテトラサイクリン誘導発現系下でコントロールするベクターをiPS細胞に導入し、咽頭弓あるいはDEの分化ステージにおいて強制発現することで副甲状腺細胞へ誘導する。分化誘導法の開発・改良と並んで分化細胞の機能評価にも引き続き取り組む。PCRによる遺伝子発現の評価以外に、PTHなどの細胞内および上清中タンパクのウエスタンブロットやELISA等の解析、免疫染色による分化細胞の同定のほか、カルシウム受容体の細胞外ドメイン認識抗体のFACSによる細胞分取などによりどのような細胞がPTH産生能を持つ分化副甲状腺細胞か確かめる。
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Research Products
(1 results)
