2020 Fiscal Year Research-status Report

A new strategy for mucosal regeneration by primary adult human epithelial progenitor/"stem cells" keratinocyte from oral mucosa

Research Project

Project/Area Number	19K10275
Research Institution	The Nippon Dental University
Principal Investigator	宮坂孝弘日本歯科大学, 生命歯学部, 准教授 (30190755)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	宮澤敦子日本歯科大学, 生命歯学部, 助教 (00706997) 古賀陽子東京女子医科大学, 医学部, 教授 (10392408) 近津大地東京医科大学, 医学部, 主任教授 (30343122) 八重垣健日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (40166468) 里見貴史日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (70276921) 松野智宣日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (80199827) 米山勇哉日本歯科大学, 生命歯学部, 助教 (10759799)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	ケラチノサイト / 口腔粘膜 / 口腔粘膜シート / 幹細胞
Outline of Annual Research Achievements	当該年度はヒト口腔粘膜より単離した口腔粘膜ケラチノサイト由来ePUKsの生物学的評価を行った。具体的には日本歯科大学附属病院口腔外科より供与された口腔粘膜組織n=３から初代ヒト口腔粘膜ケラチノサイトを従来の方法(In Vitro Cell Dev Biol Anim,54(6):413-422,2018)によって単離した。コントロール群は通常培養方法とした。その後、ePUKs 培養開始1日目から使用培地中のグルコース量を測定し、細胞の糖代謝を評価することで通常培養と ePUKs 培養との間にグルコース消費量の相違があるかを評価した。しかし個体差が大きくまた、個体数が少なかったため評価できなかった。加えて、初代ヒト口腔粘膜ケラチノサイトmonolayer 細胞のコンフルエント率とePUKs の産生量の相関を評価し、産生された ePUKs 数を連日カウントした。この際には使用培地中から採取した ePUKs の細胞生存率もセルカウンターで同時に評価したところ、コンフルエント率が上昇するにつれてePUKsの産生量とその生存率は増加する傾向にあった。しかしある一定の期間を過ぎるとePUKsの産生量は減少し、その生存率は低下した。また、ePUKsの培養中は顕微鏡下でその形態を観察した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 当該年度は新型コロナウイルスの影響もあり、当初予定していた検体数を得ることができなかった。また、得られた検体もサイズが小さく、培養に必要となる十分な細胞量が得られなかったため結果をデータ化するには至らなかった。
Strategy for Future Research Activity	新型コロナウイルスの影響は少なからずまだ続くとは思われるが、まずは検体の確保と十分な細胞量の獲得に努める。ePUKs培養においては、当該年度の研究結果から、単離した口腔粘膜ケラチノサイトの播種密度が少ないとePUKs産生量とその生存率も低くなり、加えて培養期間が延長するという結果が得られたので、当初の予定よりも播種密度を上げて細胞培養期間の短縮を図る予定である。これにより多数の異なる検体から獲得した口腔粘膜ケラチノサイトを同時に短期間で培養する。大量のePUKsを短期間に採取することが可能となれば、ePUKsを利用した口腔粘膜上皮由来細胞シートの作製も効率的に行えると考える。
Causes of Carryover	当該年度の研究が新型コロナウイルスの影響により予定通り進まなかったために必要な資材・器材の購入に至らなかった。次年度は当初の予定よりもスムーズに、また複数回繰り返しで研究が遂行できるように計画しているので、消耗品などの使用頻度が増えると思われる。また当該年度の未使用分は当初の予定通りの備品を購入する予定である。