口腔癌におけるCaveolin-1 とIL-6の役割

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K10338
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 光藤 健司 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (70303641)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 梅村 将就 横浜市立大学, 医学部, 講師 (50595353)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 口腔癌 / Caveolin-1 / TGF-β

Outline of Annual Research Achievements

カベオリン（Caveolin）は，カベオラを構成する主要な膜タンパク質であり，Cav-1，Cav-2およびCav-3からなる．中でも，Cav-1は様々な癌腫において重要な役割を持つことが報告されている．口腔癌においてCav-1が癌促進的な働きをするとの報告があり，また炎症性サイトカインの一つであるInterleukin-6(IL-6)も同様に癌促進的な働きをする報告がある．本研究では口腔癌におけるCav-1を介したIL-6の発現調節機構について発現調節モデル（細胞培養系および遺伝子操作動物）を用いて検討する．
今年度はCav-1ノックダウン細胞を作成し，IL-6刺激時の口腔癌細胞の増殖や転移・遊走の観察を行った．IL-6刺激時のCav-1ノックダウン細胞の増殖に関して，細胞生存アッセイを用いて検討を行ったところ，Cav-1がノックダウンされることでIL-6の増殖促進の機能が抑制された．転移・遊走に関しては，Cav-1ノックダウン細胞に対してIL-6刺激した際の遊走は抑制の傾向がみられたが有意な結果は得られていない．
さらに，Cav-1ノックダウン細胞にIL-6で刺激した際のシグナル伝達経路の影響を調べた．これまでの報告では，IL-6と癌と炎症の関連に関しては，様々な説が存在するが，中でも，IL-6/ STAT3シグナル伝達系が腫瘍の増殖，転移に大きく関与しており， 口腔癌においてはそれら以外にアポトーシスの促進，上皮間葉転換 (Epithelial-to-Mesenchymal Transition: EMT)などとの関与が報告されている．我々は本研究においてそれらの間の関連について検索した．その結果，Cav-1ノックダウン細胞に対してIL-6で刺激をするとSTAT3のリン酸化の発現が抑制された．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Cav-1ノックダウン細胞を作成し，IL-6刺激時の口腔癌細胞の増殖や転移・遊走の観察を行った．IL-6刺激時のCav-1ノックダウン細胞の増殖に関して細胞生存アッセイ(XTT assay)を用いて検討を行った．IL-6刺激によって，コントロール細胞では細胞の増殖が促進されたが，Cav-1ノックダウン細胞では増殖促進の変化は見られなかった．つまり，Cav-1がノックダウンされることでIL-6の増殖促進の機能が抑制された．
また，転移・遊走に関しては，Cell invasionアッセイとScratchアッセイを用いて検討を行った．Cell invasionアッセイではCav-1ノックダウンによって遊走は阻害されたが，IL-6刺激による明らかな遊走の抑制は見られなかった．ScratchアッセイではCav-1ノックダウン細胞に対してIL-6刺激した際の遊走は抑制の傾向がみられたが有意な結果は得られていない．これはn数の不足による結果であると考えており，投与するIL-6の量やStarvationの有無によっても結果が影響を受けるか検討する必要がある．全体的な研究の進捗状況としては概ね順調である．

Strategy for Future Research Activity

口腔癌細胞におけるCav-1とIL-6の相互関係の有無を調べるため，物理的な結合の有無がみられるか確認する．方法としてはCav-1ノックダウン細胞のIL-6Rやgp130の局在を調べるために，免疫沈降法を用いる．Cav-1ノックダウン細胞とコントロール細胞間でIL-6Rやgp130の検出がみられるか観察し，IL-6刺激の有無による検出の変化についても同様に検討する．
また，動物実験にも着手する．Cav-1ノックダウン細胞とcontrol shRNA細胞をそれぞれマウスの皮下に注入し生着させた口腔癌皮下腫瘍モデルを作成する．Cav-1ノックダウン細胞を生着させた動物の腫瘍部にIL-6を局所注射して経日的な腫瘍の大きさを評価し，腫瘍増殖の観察終了時には転移の有無について検討する．
腫瘍増殖の評価は1日1回の腫瘍径の計測を行い，リンパ節転移の評価にはCT撮影での判断を行う．また，リンパ節転移の次に起こりやすい肺転移の観察にはマウスの解剖を行い，摘出した肺をピクリン酸で染色し，コロニー数をカウントする(Umemura M et al. PLoS ONE. 2014)．動物実験において，Cav-1ノックダウン時に口腔癌の遠隔転移の抑制がみられるか確認することで，in vivoでも口腔癌の遊走・転移の抑制の有無を確認することができる．
これらによってCav-1がIL-6の機能調節を行うキーシグナルであるか明らかにし，治療ターゲットを見出す．最終的に，口腔癌治療における新たな治療開発に繋げていく．

Causes of Carryover

次年度使用額が生じた理由は物品費が少額となったためであり、次年度の物品費の予算として用いる。