口腔癌におけるCaveolin-1 とIL-6の役割

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K10338
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 光藤 健司 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (70303641)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 梅村 将就 横浜市立大学, 医学部, 講師 (50595353)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 口腔癌 / カベオリン1 / Interleukin-6 / 遊走能抑制効果 / IL-6/STAT3シグナル

Outline of Annual Research Achievements

Cav-1ノックダウン細胞を用い，IL-6刺激時の口腔癌細胞の転移・遊走の観察を行った．転移・遊走に関しては，Cav-1ノックダウン細胞に対してIL-6で刺激した際の遊走は抑制の傾向がみられた．癌細胞の転移メカニズムの1つとして重要とされる上皮間葉転換（Epithelial-to-Mesenchymal Transition: EMT）の関連タンパクの発現について検索を行ったところ，vimentinの発現はCav-1ノックダウン細胞で抑制されていた．E-cadherinやN-cadherinの発現の影響は見られなかった．IL-6で細胞を刺激すると，コントロールの細胞ではIL-6の刺激でvimentinの発現が促進するのに対し，ノックダウン細胞では発現促進が抑制された．このことから，口腔癌細胞においてIL-6の刺激が癌細胞のEMTを促進させる働きは，膜タンパクであるCav-1を介している可能性が示唆された．
IL-6の細胞内での主要シグナル伝達経路として知られているIL-6/STAT経路の活性の有無からIL-6とCav-1の関係についても検討を行った．その結果，口腔癌細胞に対してIL-6で刺激した際に亢進を示すSTAT3(signal transducer and activator of transcription 3)のリン酸化はCav-1のノックダウンの有無では変化がみられなかった．しかし，Cav-1ノックダウン細胞では、エネルギー代謝の調節タンパクとして知られるAMPK(AMP-activated protein kinase)のリン酸化はIL-6刺激による亢進の抑制がみられた．これはCav-1がIL-6の刺激によって起こる主要シグナル経路とは異なるシグナル経路で関与していることが示唆された．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Cav-1ノックダウン細胞を引き続き用い，IL-6刺激時の口腔癌細胞の転移・遊走の観察を引き続き行った．IL-6刺激時のCav-1ノックダウン細胞の増殖の明らかな抑制は見られなかった．このことからCav-1はIL-6による癌細胞の増殖促進効果には関与がみられないことと結果づけた．転移・遊走に関しては，Cav-1ノックダウン細胞に対してIL-6刺激した際の遊走は抑制の傾向がみられたが優位な差は見られなかった．IL-6の濃度依存的ながん細胞遊走への影響を引き続き検討する必要がある．
次に，癌細胞の転移メカニズムの1つとして重要とされるEMTとの関与に注目した．前年の結果ではEMT関連タンパクの一つであるvimentinは，がん細胞におけるCav-1ノックダウンの有無で，遊走性の亢進に差がみられた．そのほかのEMT関連タンパクにはCav-1ノックダウンの有無による発現の差は見られなかった．口腔癌細胞においてIL-6の刺激が癌細胞のEMTを促進させる働きが見られた一方で，細胞内のエネルギーセンサーであるAMPKのリン酸化がCav-1ノックダウンによって抑制されたことから，IL-6刺激による遊走性の亢進は，膜タンパクであるCav-1を通り，AMPKを介した経路の活性化によって起こっている可能性が示唆された．引き続きAMPKの上流および下流シグナルについて解明するべく，AMPKのリン酸化がどのような条件下で起こるか引き続き明らかにする必要がある．

Strategy for Future Research Activity

口腔癌細胞におけるCav-1とIL-6の相互関係について，これまではIL-6刺激によるシグナル伝達経路の解明を中心に行ってきた．その結果，細胞のエネルギーセンサーであるAMPKとの関与が明らかになった．今後はAMPKのリン酸化に関わるCaMKK2(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2)などの関連タンパクの阻害剤を用いることによって，IL-6刺激によるがん細胞の代謝変化を明らかにする．
また，これまでに実行できていない，マウスを用いた動物実験にも着手していく．動物実験では，Cav-1ノックダウン細胞とcontrol shRNA細胞をそれぞれマウスの皮下に注入し生着させた口腔癌皮下腫瘍モデルを作成する．Cav-1ノックダウン細胞を生着させた動物の腫瘍部にIL-6を局所注射して経日的な腫瘍の大きさを評価し，腫瘍増殖の観察終了時には転移の有無について検討する．
別の動物モデルとして，免疫不全マウス(BALB/c-nu/nu)の尾静脈から癌細胞の懸濁液を注入し肺転移巣ができるか観察する．この方法によって血管移行性の転移が起こるか検討する．注入から経日的な生存下での観察が必要であるため，小動物用CTによって数日おきに観察を行い，画像上で判断できる肺転移巣の数を数えることで転移の有無を確認する．これにより，Cav-1ノックダウンの有無及びIL-6刺激の有無で転移性の変化がみられるか確認する．
今後もin vitro，in vivoそれぞれでCav-1とIL-6の関りによって口腔癌の遊走・転移の制御が可能であるか確認する予定である．

Causes of Carryover

新型コロナ感染症まん延に伴う旅費の使用がなかったため次年度使用額が生じた。次年度は研究を行う際の消耗品に用いる予定である。