2019 Fiscal Year Research-status Report
Association between oral bacteria and oral cancer metastasis
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19K10350
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
大廣 洋一 北海道大学, 歯学研究院, 准教授 (40301915)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北村 哲也 北海道大学, 医学研究院, 客員研究員 (00451451)
樋田 京子 北海道大学, 歯学研究院, 教授 (40399952)
長谷部 晃 北海道大学, 歯学研究院, 教授 (90281815)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 口腔がん / 口腔常在菌 / リンパ節転移メカニズム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細菌特異的な16s rDNAの発現をPCRで確認する際，バックグラウンドの低下と，精度を向上させるために下記を行った．
1) 腫瘍組織選択的なDNA 抽出条件の検討：手術標本の残余組織を用いて，①未染のパラフィン固定された組織，②ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色された切片よりNucleoSpin DNA FFPE XSにてDNAを抽出した．HE染色により，腫瘍組織より選択的にDNAを回収できることを想定したが，HE染色によりDNA収量が30％程度以下になることを確認した．HEで染色では腫瘍部・非腫瘍部を判別するには簡便だが，DNAの抽出には不利であることがわかった．
2）ポジティブコントロールの調整：手術残余組織と細菌学教室より供与いただいたストレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans）とを混合し，DNA抽出，PCRを行った．また，同様に大腸菌（E. Coli）を材料として上記手順を行ったところ組織とS. mutansの混合物ならびにE. Coliから回収したサンプルでは16sｒDNAの発現が確認された．
3）転移リンパ節標本からのDNA抽出条件の検討：リンパ節標本（15ｘ15mm大）ならびに原発腫瘍の深部（細菌に汚染されていない部分）のみからなる薄切（4.25 μm）切片10枚よりDNAを抽出し，さらにポジティブコントロールとして大腸菌（E.Coli）由来のDNAを用いて，PCRを行ったところ30サイクルではポジティブコントロールのみで発現したが，実験群では発現は確認できなかった．PCRの条件に問題はないが，標的臓器で確認するためには，キットの選定，プライマーの設定，サイクル数などの検討が必要と考えられた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
予備実験では，バックグラウンドが高いことから組織（標本）からのDNA抽出条件，PCR条件について検討を行った．腫瘍組織を特異的に選別してDNAを抽出するためにHE染色を行うとDNA収量の低下が著しい事が判明した．予備実験当時はパラフィン切片からDNAを抽出するTakara DEXPATはワークしていたが，現在は細菌のDNA抽出の効率の高いNucleoSpinに変更して対応している．また，PCRのキットには問題ないが，PCRの試適サイクル数を検討中である．
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| Strategy for Future Research Activity |
１）DNA回収効率の向上：HE染色を行わず未染の標本からDNAを抽出し，切片からのDNAの回収効率を高める．
２）PCRの条件の改善：バックグラウンドを抑制し，16s rDNAの発現を確認できる条件を設定するため，サイクル数を段階的に増加させて条件を決定する．
３）病理組織学的転移陽性ならびに陰性のリンパ節を用いて，PCRにより細菌の存在を確認する．
４）菌腫の同定と臨床的評価項目（後発頚部リンパ節転移出現率と出現時期，全生存期間，患者背景，病理組織診断，SCC抗原）を検討し，転移に関与する菌種ならびに予後への影響を解析する．
５）in vitroにおける口腔がんに対する口腔常在菌の影響と機序解析．培養口腔がん細胞株と原因菌とを共培養し，ボイデンチャンバー法ならびにスクラッチアッセイにより運動能の変化を測定し，合わせて細胞表面の接着因子の発現の変化を測定し，転移形成能のメカニズムを解析する
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| Causes of Carryover |
組織分散装置を購入予定であったが，DNA抽出ならびにPCRの試適条件が確定したら購入を検討する．
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