Association between oral bacteria and oral cancer metastasis

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K10350
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 大廣 洋一 北海道大学, 歯学研究院, 准教授 (40301915)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 北村 哲也 北海道大学, 医学研究院, 客員研究員 (00451451) ; 樋田 京子 北海道大学, 歯学研究院, 教授 (40399952) ; 長谷部 晃 北海道大学, 歯学研究院, 教授 (90281815)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 口腔がん / 口腔常在菌 / 悪性化 / リンパ節転移

Outline of Annual Research Achievements

２０１９年度に課題であった再現性が確認された．大きな変更点はPCRサイクル数を３０サイクルから５０サイクルに増加させた事である．サイクル数の増加に伴うバックグラウンドの増強は検討に影響することはなかった．これにより細菌由来の 16s rDNAの検出が可能になった．また，検討対象とした症例の個体差を排除するために以下を行った．舌がん後発転移症例の同一の頸部郭清組織より得られたリンパ節のうち，病理組織学的に転移を認めたリンパ節と転移を認めなかったリンパ節の未染色のパラフィン包埋切片からDNAを回収し，各検体における細菌由来の 16s rDNAを検出した．この検討により，舌がん後発転移６症例のうち，リンパ節における細菌由来の16s rDNAは5症例に認められ，1症例で検出されなかった．また，病理組織学的転移陽性または転移陰性の診断と，PCRにおける16s rDNAの診断における有用性を検討したが，正確度は６９．２％，感度は５７．１％，特異度は８３．３％であったことから，特異度が高い結果となった．また，転移リンパ節の病理組織学的特徴を壊死の程度，原発では，浸潤の程度で評価したが，どちらの項目も，細菌由来の16s rDNAの発現に関係している可能性は低い結果が得られている．原発巣において転移に関わる可能性があるポドプラニンの発現を免疫組織学的に検討したが，検討し得た症例はまだ少なく本年度症例を蓄積する必要があると考えた．また，臨床における本研究の意義を高めるためには，原発腫瘍における細菌由来の16s rDNAの発現を検討し，後発転移に関係するか否かさらに検討することも本年度の検討課題とした．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

舌がん後発転移６症例の頸部郭清術より得られたリンパ節の未染色のパラフィン包埋切片からDNAを回収した．対象としたリンパ節は病理組織学的に転移を認めたリンパ節と転移を認めなかったリンパ節とし，それぞれからDNAを回収した．E.coliならびにS. mutansをポジティブコントロールとして，５０サイクルでPCRを実施し，細菌由来の 16s rDNAの発現を検討し，以下の結果を得た．
１）病理組織学的に転移陽性と診断した６症例７個のリンパ節のうち，４個のリンパ節において16s rDNAが検出されたのに対して，同一６症例の転移陰性と診断した６個のリンパ節において１個のリンパ節において16s rDNAが検出された．正確度は69.2%（9/13），感度は57.1%（4/7），特異度は83.3％（5/6）であった．
２）病理組織学的に評価し得た転移陽性リンパ節6個中に壊死部分が多数のものは2個，約半分のものは1個，少数であるものは3個であったが，壊死範囲の大きさとPCRの結果には関係性はないと考えられた．

Strategy for Future Research Activity

１）今回検討した6症例のうち，5症例のリンパ節で病理組織学的な転移陽性陰性にかかわらず細菌由来の 16s rDNAを検出したことから原発巣における細菌由来の16s rDNAが存在するか検討する．ただし，腫瘍の表層は口腔に接しているのでH-E染色後に表層を削り取り，腫瘍深部からDNAを回収する．
２）原発巣とリンパ節の双方で細菌由来の16s rDNAが検出された症例においては，細菌叢の検討をTAKARAバイオに外注し検討する．
３）さらに，リンパ節転移に関わる原発腫瘍の生物学的特性を捉えるためにリンパ管侵襲を抗ポドプラニン抗体（D2-40）で免疫組織学的に検討する．
４）菌腫の同定と臨床的評価項目（後発頚部リンパ節転移出現率と出現時期，全生存期間，患者背景，病理組織診断，SCC抗原）を検討し，転移に関与する菌種ならびに予後への影響を解析する．
５）in vitroにおける口腔がんに対する口腔常在菌の影響と機序解析．培養口腔がん細胞株と原因菌とを共培養し，ボイデンチャンバー法ならびにスクラッチアッセイにより運動能の変化を測定し，合わせて細胞表面の接着因子の発現の変化を測定し，転移形成能のメカニズムを解析する．

Causes of Carryover

条件設定のためPCRに実験を集中させたため，試薬費用・消耗品が限定された．次年度は原発巣の細菌由来の核酸を検討し，細菌叢の解析にかかる費用に運用する予定である．