2021 Fiscal Year Research-status Report
蛍光イメージングを利用した小児の歯髄炎の概日リズム判定
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19K10394
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| Research Institution | Health Sciences University of Hokkaido |
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Principal Investigator |
西出 真也 北海道医療大学, リハビリテーション科学部, 講師 (40451398)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 概日リズム / 蛍光イメージング / 口腔保健 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウス歯髄の炎症反応にみられる概日リズムの測定を目的として、培養細胞株を用いて炎症マーカーMAPK活性をFRETで測定する実験を実施した。FRETとは2種の蛍光タンパク質が近接した際に起こる分子間のエネルギー移動現象であり、MAPKが活性されるとFRETが起こるように設計されたバイオセンサーを細胞に発現させた。MAPKは炎症などの刺激によりリン酸化され活性化し、活性化したMAPKは細胞内の別の分子に作用することにより炎症などの刺激を伝達する。本研究ではMAPK分子群のうちERKおよびJNKを選びバイオセンサーを作成した。バイオセンサーを導入した培養細胞に様々な時間帯において炎症惹起物質を投与したところ、MAPKの反応は時刻依存的に変化することが示された。この時刻依存性は時計遺伝子を欠失した概日リズムを示さない細胞にはみられなかったことから、実験環境等による炎症惹起物質の作用の違いではなく、細胞自体に備わる概日リズムによるものであることが示された。次にバイオセンサーを動物に導入し、動物の概日リズムと炎症反応の関連を解析する系を立ち上げることを目的として、まずマウスの概日リズムを赤外線センサーおよび回転輪活動によって24時間行動測定するシステムを構築した。マウスをケージごとに個別に照明条件を変えられる箱に入れ、タイマー制御で照明のオン・オフをすることができる。上記の箱の中で、ADInstruments社のPowerLabをActimetrics社のClockLabソフトウェアを用いて制御することによりマウスの行動を連続測定し概日リズム特性を解析した。同時にマウスの様々な組織の概日リズム関連遺伝子、炎症関連遺伝子の概日変動を定量的RT-PCRにて解析した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
マウス、ラットの歯髄組織の炎症関連分子、概日リズム関連分子の概日変動の測定は困難であったため、他の組織の概日変動の実験に切り替えた。またセットアップした行動測定システムの不具合のトラブルシューティングに時間を要した。現在は問題なく行動分析を行うことができている。
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| Strategy for Future Research Activity |
マウス組織を様々な時刻に採取し、炎症関連遺伝子や時計遺伝子発現を定量的RT-PCR法にて計測する実験を引き続き行う。炎症関連遺伝子のリズムと行動リズムとの位相（時刻）関係を解析し、炎症反応にみられるリズムの特性を明らかにする。マウス行動リズムを連続測定しながら、活動期や休息期など、様々な時点で組織を採取しMAPKバイオセンサーを導入して反応を調べる。採取した歯髄組織を初代培養し、レンチウィルス等を用いてMAPKバイオセンサーを導入する。蛍光顕微鏡にてタイムラプス観察し、歯髄のMAPK活性の炎症刺激に対する反応を解析する。
次に12時間照明オン、12時間照明オフの24時間周期の下で飼育されたマウスの照明を８時間後ろにずらす。この操作によりマウスに人工的に時差ぼけを起こした後、組織を採取しRT-PCRによる時計遺伝子発現解析およびバイオセンサーによるMAPK活性測定を行う。
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| Causes of Carryover |
遺伝子解析、バイオセンサー導入実験、行動解析実験の遅れのため、次年度も引き続き実験を行う。また学術雑誌への投稿を予定している。
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