異常なエピジェネティック制御機構が引き起こす口蓋裂発症メカニズムの解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K10398
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 東堀 紀尚 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (50585221)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: エピジェネティック / 口蓋裂 / ヒストンメチル化酵素

Outline of Annual Research Achievements

口唇裂・口蓋裂は、600人に一人と高頻度に認められる先天異常疾患である。遺伝的要因と環境要因との相互作用によって発症する多因子疾患であるが、発症メカニズムは未だ不明な点が多い。近年、エピジェネティックな変化が疾患の発症要因になっていることが報告されているが、口唇裂・口蓋裂を始めとした顎顔面領域における先天異常疾患とエピジェネティックな変化についての報告は少ない。本研究は、神経堤細胞にのみヒストンメチル化酵素Setdb1をノックアウト(Setdb1 CKO)させ、口蓋裂を発症させたマウスを実験モデルとして用い、口蓋におけるSetdb1を中心としたエピジェネティックな遺伝子制御メカニズムについて研究を進めている。
当該年度は、1) 網羅的解析のため適切なステージのサンプルを採取する前段階の表現型解析、2) 口蓋から網羅的解析のために十分量なRNAが採取できる間葉細胞の単離が可能かどうかの検討、また、3) 口蓋と同じ様に間葉細胞である軟骨細胞においても表現系が認められるため、セルライン化された軟骨細胞でのSetdb1のシグナル制御メカニズムについて検討を行った。
1) については、表現系が確認できるのはE12.5付近からであるため、E12.5もしくはそれ以前のE11あたりが妥当ではないかとの結果が得られた。2)については、E12.5だとwild-typeのマウス口蓋からでもRNAの収穫量が少ない。E13.5のwild-typeからは十分量なRNAの収穫が確認できた。しかしながら、Setdb1 CKOの口蓋はwild-typeと比較し小さいため、収穫する際の手技の検討や、増幅方法も検討する必要があると思われる。3) 軟骨細胞ATDC5においてPTHレセプターの発現および細胞局在に影響があることがわかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

マウスの繁殖が予定通りに進んでいないため、収穫量の検討が十分行えていない。今後は、代替え案としてRNAの増幅方法の検討も考慮する。また、Setdb1 CKOは軟骨細胞にも異常が認められるため、異種の細胞ではあるが重複するシグナルも関与していると考えられるため、同時に軟骨細胞でのメカニズムについても検討している。

Strategy for Future Research Activity

本研究は、ユビキタスに存在するSetdb1がなぜ口蓋特異的に影響を与えているかの解明が目的であるため、網羅的な解析が必須である。そのため、Setdb1が口蓋発生に影響を与えるステージの特定およびそのステージにおける十分なRNAの収穫量の獲得方法が鍵となってくる。表現型解析よりステージはある程度解明出来たもの、十分量収穫可能かどうかの検討が今後も必要である。また、十分量なRNAの収穫が困難である場合を考慮し、増幅方法の検討も必要である。増幅に関しては、研究計画時考慮していない、新規の課題である。
Setdb1 CKOは口蓋裂という表現型の他にメッケル軟骨にも異常が認めれる。軟骨細胞はセルライン化されているため、RNAiによるSetdb1のノックダウンをin vitroにて進め、Setdb1による軟骨細胞におけるシグナル制御の解明を行うことにより、口蓋でのSetdb1の機能解明のヒントに繋がるのではないかと、同時並行で研究を進めていく方針である。

Causes of Carryover

概ね予定通りの使用となった。余分をもたせ使用した結果、31,088円の余剰となった。