2020 Fiscal Year Research-status Report
エキソソームデリバリーsiRNAを用いた頭蓋骨縫合癒合症の治療法開発基盤構築
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19K10400
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
小林 起穂 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (20596233)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 頭蓋骨縫合癒合症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体内のあらゆる細胞が分泌し血中を循環するナノ分泌顆粒をエクソソームと呼ぶ。癌をはじめとする様々な疾患のバイオマーカーとして注目を集める一方、生体に備わった分子輸送機構であり、新規ドラッグデリバリーシステム（DDS）の候補とされている。様々な核酸医薬のなかでも、低分子干渉RNA（siRNA）は標的配列に高い特異性を示すが、生体内での安定性が低く創薬研究が進まなかったが、2018年に世界初のPEGリポソーム輸送型siRNA医薬品が米国FDAで承認された。一方、頭蓋骨縫合癒合症を主徴とするアペール症候群は、FGFR2の機能獲得型点突然変異によるアミノ酸置換により発症する。本研究は、アペール症候群モデルマウス点変異特異的siRNAをエクソソームにより輸送し、マウス頭蓋顎顔面縫合発生に対する影響をin vitroおよびin vivoにて解析することを目的とした。得られる結果は、広く先天性疾患を対象としたsiRNA創薬の発展へと波及することが期待される。エキソソーム-siRNAFgfr2S252Wの構築は、まずPureExo エキソソーム単離キットを用いてマウス血清からエキソソームを単離精製し、エキソソーム特異的バイオマーカー（CD9,CD63,CD44,Hsp70 ）の発現をウェスタンブロット法にて確認した。蛍光標識させたマウスFgfr2エクソン7に存在する点変異特異的siRNAをエクソソーム内に導入し、培養細胞に作用させることで細胞質内に導入されることを確認した。胎生期（E15.5）野生型マウスおよび当分野で飼育中のcraniosynostosisを発症するApert症候群モデルマウス頭蓋冠縫合部を発生段階毎に摘出し、組織より骨芽細胞を分離培養し、現在エキソソームデリバーリーによる機能解析実験を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までに、野生型マウスsiRNAのエキソソームの単離を行い、単離効率の最適化を行った。また、エキソソーム単離の確認のため、エキソソーム特異的バイオマーカーの発現をウェスタンブロット法にて確認した。また、蛍光色素で標識したsiRNAFgfr2S252Wをエキソソームに内包させ、培養細胞に作用させると、細胞質内に取り込まれることを蛍光顕微鏡にて観察できた。現在In vitro細胞培養系におけるEx-siRNAFgfr2S252Wの機能解析およびIn vitroマウス頭蓋骨器官培養系におけるEx-siRNAFgfr2S252Wの機能解析を遂行中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
Ex-siRNAFgfr2S252Wの投与を行い、Apert疾患モデルマウス頭蓋冠縫合部にて発生時期特異的に有為な発現上昇および低下を示すmRNAおよびMAPK経路因子リン酸化について解析する。また、冠状縫合の器官培養系にEx-siRNAFgfr2S252Wを添加、whole mount in situ hybridizationおよびIHCにて解析する。また、細胞増殖、分化、細胞死の観点から解析を行う。最終的には妊娠アペールマウスにEx-siRNAFgfr2S252Wを尾静脈投与し、胎児への移行の確認後、胎児頭蓋骨発生、形態形成の解析を行う。
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Research Products
(3 results)
