新規三次元骨細胞分化誘導培養法を応用した骨代謝疾患へのアプローチの提案

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K10404
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 村田 有香 大阪大学, 歯学研究科, 助教 (90755068)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 黒坂 寛 大阪大学, 歯学部附属病院, 講師 (20509369) ; 犬伏 俊博 大阪大学, 歯学研究科, 講師 (30550941) ; 伊藤 慎将 大阪大学, 歯学研究科, 助教 (40633706) ; 佐々木 淳一 大阪大学, 歯学研究科, 講師 (50530490) ; 山城 隆 大阪大学, 歯学研究科, 教授 (70294428)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 骨細胞 / 骨芽細胞

Outline of Annual Research Achievements

骨細胞は、骨基質内で細胞間ネットワークを介してメカニカルストレスを感知し、様々な遺伝子やタンパクを発現して骨代謝を調節することで、骨組織内における細胞のコミュニケーションの中心的役割を果たしている。これまでに研究代表者は、2015年度の基盤(C)研究によりMC3T3-E1細胞の三次元コラーゲンゲル培養を行い、リン酸添加や低酸素条件をはじめとする骨細胞分化誘導因子を作用させることで、効果的に未分化間葉系幹細胞を骨芽細胞および骨細胞へと分化誘導させる新たな手法を確立した。
本研究は、研究代表者が確立したMC3T3-E1細胞ならびにIDG-SW3細胞を用いた新規三次元骨細胞分化誘導培養法を用いて、骨細胞の分化に必須の転写因子を同定し、さらにこれらの転写因子を用いた新規骨細胞分化誘導法を確立することを目的とした。
昨年度、我々は、MC3T3-E1細胞だけでなく、IDG-SW3細胞の培養に新規三次元骨細胞分化誘導培養法を応用することで骨細胞への分化能を検討し、IDG-SW3細胞を用いた新規三次元骨細胞分化誘導培養法を応用した培養実験の有用性を示した。
本年度、我々は、骨細胞分化に関連する転写因子の探索にあたって、Dmp1-GFPマウスの頭蓋冠から採取したGFP陽性初代培養骨細胞の特性について検討した。GFP陰性細胞群では、培養10日後において石灰化は認められず、19日後に石灰化がわずかに認められたが、GFPの発現はほとんど認められなかった。一方、GFP陽性細胞群では、培養10日後において石灰化が認められ、GFPの発現が上昇していた。19日後には骨梁様構造の石灰化形成を認め、さらに同部位にGFP発現細胞の集積を認めた。これらのことから、GFP陽性初代培養骨細胞を用いた培養実験の有用性が示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初代培養骨細胞を用いた培養実験の検討に当初の計画より時間を要したが、全体的にはおおむね順調に進行している。

Strategy for Future Research Activity

今後は、GFP陽性初代培養骨細胞ならびに新規三次元骨細胞分化誘導培養法を応用して培養したMC3T3-E1細胞ならびにIDG-SW3細胞を用いて、マイクロアレイによる網羅的解析で検出した骨細胞にて高発現の認められる転写因子の遺伝子発現をリアルタイムPCR法にて確認する。さらに、標的遺伝子のノックアウト細胞を作製して培養し、骨細胞分化マーカー遺伝子発現ならびに形態学的解析を行うことで標的遺伝子の骨細胞分化における役割を解析する。これにより骨細胞分化に関わる転写因子を検索する。