歯周炎発症カニクイザルを用いた病原細菌の特定と細菌伝播経路の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K10455
• Research Institution: Kanagawa Dental College
• Principal Investigator: 平嶺 浩子 神奈川歯科大学, 歯学部, 助教 (30386841)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 浜田 信城 神奈川歯科大学, 歯学部, 教授 (20247315) ; 渡辺 清子 神奈川歯科大学, 歯学部, 准教授 (70148021) ; 児玉 利朗 神奈川歯科大学, 歯学部, 教授 (20170269) ; 小牧 基浩 神奈川歯科大学, 歯学部, 准教授 (30401368) ; 山海 直 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 医薬基盤研究所 霊長類医科学研究センター, 再雇用職員 (80300937)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 歯周炎 / P. macacae / カニクイザル

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、歯周炎罹患カニクイザルの歯垢サンプルからの歯周炎の病原細菌の特定および分離菌株の病原因子、伝播経路を解明することを目的としている。
当該年度（2021年）は、①口腔内検診にて、カニクイザル口腔内から綿棒を用いて歯垢を採取し、DNAを抽出し菌種特異的PCRプライマーを用いて菌種の存在と鑑別を行った。平板培地に塗抹し発育したBPAR分離菌株の性状検査を行い、菌種の同定を行った。②カニクイザルの歯周ポケットから分離されると報告されているPorphyromonas macacae (P. macacae)感染によりラット実験的歯周炎モデルを用いて、歯槽骨吸収について、マイクロCTを用いて評価を行った。また、ラット歯槽骨病理組織標本を作製し、破骨細胞誘導について比較検討を行った。その結果、①菌種特異的アミノ酸配列である16S ribosomal DNA (rDNA)をターゲットとし設計したprimerを使用した。カニクイザル口腔内から採取した歯垢細菌からDNA抽出を行い、PCR法を用いた結果P. macacaeは、全体の57%検出された。培養法にて口腔内細菌の分離・同定は、BHI血液寒天培地とPorphyromonas 選択培地であるKVLB培地を用いて行った。総菌数と黒色色素 産生嫌気性桿菌 (以下BPAR) の比率を算出した。歯垢の総菌数は、3群ともに同程度であった。また、BPARはYoung群(0-9歳)とOld群(20歳以上)を比較すると約5倍、Old群に多く検出された。BPAR分離菌株は、0-9歳に比べMidle群(10-19歳)では3倍検出され、Old群では5倍多く検出された。年齢とともにBPAR分離菌株検出率も増加することが分かった。②実験的歯周炎では、P. macacae感染群は、非感染群と比較し明らかな歯槽骨吸収が認められた。また、P. macacae感染群は、ヒト慢性歯周炎の原因細菌であるP. gingivalis 感染群とP. salivosa 感染群と同程度の歯槽骨吸収が認められた。ラット歯槽骨病理組織標本を作製し、TRAP染色を行い、破骨細胞を確認した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

2021年度は、引き続き、新型コロナウイルス感染症による影響のため、研究のための出張を自粛していたため、霊長類医科学 研究センターでのサル口腔内検診を実施できない状況であった。よって、新たなサンプリングはできていない。マイクロCTを用いたラットを用いた実験的歯周炎で歯槽骨吸収について検討した。P. macacae感染群は、非感染群と比較し明らかな歯槽骨吸収が認められたため、P. macacaeは、歯槽骨吸収に関わる病原性を有していることが分かった。菌種特異的PCRプライマーを用いてP. macacae の検出・同定を試みて、良好な結果が得られている。BPAR分離菌株は、性状検査を行いBPAR分離菌株の同定を行っていく。ラット歯槽骨病理組織標本の破骨細胞についての評価についても今後検討を行う。また、新型コロナウイルスの影響のため今年度の新たなサンプリングについては、遅れている状況であるが、今後も検体数を増やしていく予定である。以上の結果については、全体的に良好な結果が得られているが、研究としては、当初の予定よりも遅れている状況である

Strategy for Future Research Activity

新型コロナウイルス感染症による影響のため、口腔内検診実施時に新規サンプリングを行い、検体数を増やし検討を行う。実験的歯周炎でラット歯槽骨の病理組織標本にTRAP染色を行い、破骨細胞について比較検討する。
菌種特異的PCRプライマーを用いてP. macacae の検出・同定を行う。BPAR分離菌株は、性状検査を行いBPAR分離菌株の同定を行っていく。感染伝播経路（垂直・水平）の検索のために、親子関係を調査する。感染伝播経路については、制限酵素切断パターンの比較検討する。

Causes of Carryover

新型コロナウイルスの影響により、研究の進捗状況が遅れている。学会準備費や旅費として計上することができなかった。次年度については、細菌・細胞培養の為の試薬、論文作成に関わる物品等を購入する予定である。