2020 Fiscal Year Research-status Report

小胞体ストレスシグナリングカスケードに着目した重金属毒性抑制機構

Research Project

Project/Area Number	19K10582
Research Institution	Tokyo Women's Medical University
Principal Investigator	松岡雅人東京女子医科大学, 医学部, 教授 (50209516)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	小胞体ストレス / シグナル伝達 / 重金属 / カドミウム / サルブリナル
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、重金属ばく露における小胞体ストレス軽減物質サルブリナルによる細胞死抑制効果について、主要な小胞体ストレスシグナリングPERK（double-stranded RNA-activated protein kinase-like ER kinase）経路に着目し、翻訳開始因子eIF2α、転写因子ATF4およびオートファジーを含む細胞死を解析することにより、その分子基盤を明らかにすることを目的とする。2019年度は代表的な環境汚染物質であるカドミウムばく露に対するサルブリナル処理の気道上皮・肺胞上皮細胞と近位尿細管細胞における効果の違いを明らかにし、2020年度は神経細胞（SH-SY5Yヒト神経芽細胞腫）へのカドミウムばく露の影響を検討し、以下の知見を得た。（１）カドミウム濃度依存的にSFアッセイによる細胞生存率の低下が認められ、サルブリナル処理は細胞生存率低下を抑制した。（２）カドミウム濃度依存的にリン酸化型eIF2α、GRP78、p62、LC3B蛋白レベルの上昇が認められ、サルブリナル処理はこの上昇を増強した。一方、ATF4蛋白レベルの明らかな変動は認められなかった。（３）細胞死を誘導するCHOPのmRNAレベルはカドミウム濃度依存的に上昇し、サルブリナル処理はこの上昇を抑制した。（４）Cyto-IDで蛍光標識した細胞内のオートファゴソームは、カドミウムばく露で上昇し、サルブリナル処理はこの上昇を増強した。以上の結果から、近位尿細管細胞と同様に神経細胞において、カドミウムばく露による細胞死に対するサルブリナル処理の抑制効果を明らかにした。分子基盤として、サルブリナルが持続的にeIF2αのリン酸化を持続させる結果、小胞体ストレスとオートファジーが同時に機能する一方、細胞死を誘導するCHOP発現を抑制することにより、細胞生存にバランスがシフトする可能性が考えられた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 2019年度はこれまでに報告の無かったカドミウムをばく露した気道上皮細胞、肺胞上皮細胞におけるサルブリナルの影響を検討し、2020年度は神経細胞への影響を検討したところ、その効果を確認した。次年度以降はこれまでの知見を元に、近位尿細管上皮細胞および神経細胞を用いた重金属ばく露による細胞死に限定した実験へと展開することが出来る。また、モデル生物である線虫を用いたカドミウムばく露の寿命、行動および生体影響に関する実験に着手しているところである。
Strategy for Future Research Activity	今後、in vitro実験では、重金属ばく露による小胞体ストレス応答とオートファジーとの協働による標的細胞の生存・死決定機構を検討する。2021年度は、カドミウムをばく露した近位尿細管由来上皮細胞（HK-2、LLC-PK1）、カドミウム、鉛およびトリブチルスズをばく露した神経細胞（SH-SY5Y、PC12）における小胞体ストレス応答（PERK、ATF6、IRE1経路）、MAPキナーゼ（ERK、JNK、p38経路）、転写因子NF-κB、オートファジーを含む細胞死制御機構と、これらの変動に対するサルブリナルの効果についての解析を行う。また、小胞体ストレスを生じることが予想される他の金属・半金属（銅、ヒ素、クロム、バナジウム）や化学物質（パラコート、ロテノン、ベンゾピレン、シスプラチン）を標的細胞にばく露し、サルブリナルによる中毒性細胞障害の抑制効果を検討する。次いで、他のケミカルシャペロンや小胞体ストレス応答軽減物質の重金属ばく露による中毒性細胞死に対する抑制効果を検討する。培養細胞実験系にて毒性金属ばく露によるサルブリナルの効果を検討した上で、最終的にはその生理機能をモデル動物（ゼブラフィッシュおよび線虫）を用いたin vivo実験系にて確認する計画である。
Causes of Carryover	国内・国外出張などの旅費を使用する研究発表活動ができなかったため、予算を次年度に繰り越すこととなった。また、2020年度は2019年度と類似のin vitro実験系であったため、新規の試薬や多量の消耗品などの購入は必要とせず、研究室が保有する試薬や消耗品でその一部を賄うことができた。 2021年度は、試料数の大幅な増加および新規測定・評価系の確立のため、試薬や消耗品の購入額の増加が見込まれるので、繰り越した予算を支出する計画である。また、新規のin vivo実験に要する費用にも充てる。