ゲノム編集技術を用いた1,2-ジクロロプロパンの毒性機序の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K10589
• Research Institution: National Defense Medical College
• Principal Investigator: 吉岡 範幸 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 衛生学公衆衛生学, 助教 (70365229)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 1,2-ジクロロプロパン

Outline of Annual Research Achievements

塩素系有機溶剤である1,2-ジクロロプロパン(DCP)やジクロロメタン(DCM)が使用されていた印刷事業場の従業員に胆管がんが多発したが、ヒトにおいてみられたこの胆管がんは動物実験では再現できていない。これはヒトと動物ではこれらの有機溶剤に関与する薬物代謝酵素の種類や発現量が異なることが考えられている。本研究は1,2-ジクロロプロパンの曝露により、胆管がんが発生するメカニズムを解明するために、ヒトiPS細胞由来肝細胞等や株化細胞を用い、ゲノム編集技術を使ったCRISPR sgRNAライブラリーによるノックアウトスクリーニングを行い、胆管がん発生に関与する遺伝子を探索することが目的である。2020年度はHepG2、MMNK-1への1,2-ジクロロプロパン曝露、HepG2とMMNK-1の共培養への1,2-ジクロロプロパン曝露を行い、DNA損傷マーカーであるγH2AXの蛍光免疫染色を行なった。HepG2、MMNK-1への高濃度の1,2-ジクロロプロパン曝露がγH2AXを生成させることが確認できたがセルカルチャーインサートを使った共培養では確認できなかったため、培養方法、曝露方法、曝露時間等を検討している。また、ノックアウトスクリーニングの準備として、ヌクレアーゼであるCas9の安定発現細胞株を作製するためにlentiCas9-BlastをMMNK-1にレンチウイルスベクターによる遺伝子導入を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

効率的な研究推進のため今年度は曝露条件の設定を中心に行なった。

Strategy for Future Research Activity

曝露条件が決まり次第、研究計画に沿ってノックアウトスクリーニングを行い、胆管がん発生に関与する遺伝子を探索する。

Causes of Carryover

次世代シーケンサー解析の受託費用を次年度に使用するためである。次年度は受託費、成果発表のための旅費に充当する予定である。