2019 Fiscal Year Research-status Report
リトコール酸によるビリン発現抑制におけるSRFの役割に関する研究
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19K10684
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
尾関 宗孝 京都大学, 医学研究科, 助教 (80549618)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 肝臓 / 胆汁鬱滞 / ビリン / リトコール酸 / MRTF / SRF |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト肝癌細胞HepG2細胞よりゲノムDNAを調整し、ビリンプロモーター転写開始点より上流100bpをクローニングしてルシフェラーゼレポーターアッセイベクターを作成した。本ベクターから転写因子SRFの結合配列であるCArG Boxを欠如させるとルシフェラーゼ活性がほぼ認められなくなり、この領域においてはCArG Boxが必須であるとともに唯一の発現調節部位であることが示唆された。また、siRNAによりSRFをノックダウンすることでルシフェラーゼ活性は有意に低下し、このときビリンmRNA発現量についても有意に低下が認められたことから、HepG2細胞においてSRFがCArG Box配列を介してビリン発現に大きく関わっていることを明らかにした。一方、HepG2細胞をリトコール酸で刺激してもSRFの発現量に変化は認められず、リン酸化状態も特に変わらなかった。そこで、SRF自身ではなくコアクチベーターによるSRFの活性化に変化があるものと考え、アクチン細胞骨格の調整に関与していることが知られているMRTFA、MRTFBに着目した。MRTFA、MRTFB共にリトコール酸刺激に対する発現量の変化は認められなかったが、MRTFBはリトコール酸刺激下において細胞内局在を変化させ、細胞質から核への移行が観察された。HepG2細胞においてMRTFAおよびMRTFBをsiRNAによりノックダウンすると、少々ながらビリン発現の上昇が認められた。一方、ノックダウンした状態でリトコール酸により刺激すると、ビリン発現は有意に低下した。これらのことからMRTFAおよびMRTFBがSRFによるビリン発現調節に関わっていることが推察されたが、その詳細を明らかにするには至っておらず今後の課題となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度の研究計画では、転写因子SRFのビリンプロモーター上のCArG Box配列への結合について、リトコール酸刺激による影響をゲルシフトアッセイを用いて定量的に解析することを到達目標としていた。しかしながら、ゲルシフトアッセイおよび抗SRF抗体を用いたスーパーシフトの再現性が低く、本研究の遂行に適していないと判断し、ゲルシフトアッセイによる解析を断念した。代替案として間接的ではあるがsiRNAを用いたノックダウンによりSRFのビリン転写制御への関与を調べることとした。SRFとそのコアクチベーターであるMRTFAおよびMRTFBのノックダウンは再現よく良好な結果を得ることができたので、レポーターアッセイやリアルタイムPCRといった手法を組み合わせることにより研究を進めたところ、HepG2細胞におけるビリンmRNA発現調節にSRF、MRTFA、MRTFBが関与していることが示唆された。当初の目的のようにSRFのプロモータへの結合を定量的に解析することはできなかったものの、SRFのみならずコアクチベーターのMRTFAやMRTFBの関与まで示すことができ、さらにはMRTFAおよびMRTFBのリトコール酸刺激下における細胞局在の変化といった予想していなかった知見を得られたこと等を考慮し、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2年目の研究計画では、転写因子複合体構成タンパク質の同定を目標としている。これまでの研究結果から、siRNAを用いたノックダウンによる実験データからHepG2細胞におけるビリン発現において転写因子SRFとそのコアクチベーターであるMRTFAまたはMRTFBが関与していることが示唆された。MRTFAおよびMRTFBはSRFのコアクチエベーターであることから、SRFがMRTFAもしくはMRTFBのいずれかと共に複合体を形成してビリン転写制御に関わっているものと推察される。そこで次年度においては、まずMRTFAおよびMRTFBがSRFと複合体を形成していることを示し、その上でこれらの複合体がビリンプロモーター上のCArG Box配列に結合すること、の2点について明確にすることを到達目標とする。研究手法としてゲルシフトアッセイを用いるのが最も適していると考えられるため再度試みることとするが、必要に応じて免疫沈降、Chipアッセイ等他の手法も検討することとする。特に免疫沈降を用いた検討では、MRTFAやMRTFB以外の因子の探索も期待される。その場合、新規関与因子の追求も行っていく。また、これらの実験に際してMRTFAおよびMRTFBのリトコール酸に対する応答やビリン転写調節に対する作用の違いについても検討することとし、これまでに得られた細胞内局在の差異に関する知見と合わせて、SRFによるビリン転写制御とリトコール酸刺激に対する応答のメカニズムについて考察する。
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