2019 Fiscal Year Research-status Report

Role of meningeal lymphatics for traumatic brain injury

Research Project

Project/Area Number	19K10695
Research Institution	Tokyo Women's Medical University
Principal Investigator	島田亮東京女子医科大学, 医学部, 准教授 (10376725)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	髄膜リンパ管 / 脳損傷
Outline of Annual Research Achievements	髄膜リンパ機能の障害は、脳への巨大分子の血管内流入および間質液からの巨大分子の流出を遅らせ、マウスにおける認知障害を誘発すると最近報告されている。脳損傷歴のある者は認知症やアルツハイマー病が罹患しやすいと知られている。脳損傷と細胞老化を特徴とする晩年の認知症やアルツハイマー病と直接結びつくのに限界がある。脳損傷がどのように細胞老化させたかのメカニズムはまだはっきりと分かっていない。ここで、脳損傷は髄膜リンパ機能に悪影響を与え、晩年の認知症やアルツハイマー病に結びつくと考える。本研究は脳損傷後髄膜リンパ管経時的に早期から晩年期までどのように変化しているかと髄膜リンパ管の障害は脳損傷後認知機能に対しどのように関与しているかを解析するという二つの目的である。１．動物実験。①Impact Deviceを用いて、マウスの外傷性脳損傷を作製。損傷後1日、4日、1週間、2週間の処置群とSham群をそれぞれ作製する。何も処置しない群をコントロール群とする。②サンプルの処理：脳損傷後所定時間に、マウスを深麻酔下、緩衝液を灌流し安楽死させ、硬膜、脳を摘出する。 2．硬膜の髄膜リンパ管細胞の分離。Collagenase Ⅷを用いて、細胞を分離する。標識したPodoplamin抗体で特異的に髄膜リンパ管細胞と反応させ、フローサイトメントリのセルソータの機能を使い、髄膜リンパ管細胞を採取。採取された髄膜リンパ管細胞のRNAを抽出し、次世代シクエンサーにて網羅的遺伝子発現解析を行う。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 動物実験及び細胞分離の方法は予定通り確定できたが、予想よりマウスの硬膜は薄く、小さく、一匹では十分な細胞数を得られず、一次スクリーニング：TruSeq stranded mRNA library prep 或はTruSeq Targeted RNA Expression Custom Panelキットでサンプル調整し、Illumina Novaseq6000装置(アプロサイエンスによるmRNAシーケンス(RNA-Seq)受託解析にて)を用い、4Gb/sample, 100 base或は0.3Gb/sample, 75 base, paired endデータ量を得られ、マッピング・発現値算出・発現変動比較解析を行い、Pathwayを探索することは遅れている。
Strategy for Future Research Activity	1.一次スクリーニングの次世代シクエンサーによる網羅的遺伝子発現解析を行う。さらに、二次スクリーニングはRealtime PCRによるmRNA発現、ELISAによるタンパク発現の解析で一次スクリーニングによる得られた結果が正確か否か確認する。 2.動物実験は、さらに、マウスの脳損傷の損傷後、4週間、12週、24週、48週、72週の処置群とSham群をそれぞれ作製する。何も処置しない群をコントロール群とする。サンプルの処理について、脳損傷後所定時間に、マウスを深麻酔下、緩衝液を灌流し安楽死させる。それぞれRNA抽出及びタンパク抽出のため処理し、そのサンプルを-80℃保存する。 3.mRNAの発現解析。Realtime PCRを行う。Applied Biosystems のキットを用いて、cDNAへ逆転写し、Applied Biosystems StepOnePlusリアルタイムPCRシステムを利用して定量解析を行う。解析する遺伝子は二次スクリーニングで確認できた有意に変動する老化に関わる遺伝子。 4.タンパクの発現解析。ELISAを用いて、3．のmRNAから転写されたタンパクの発現解析を行う。mRNAとタンパク発現の相関性を確認する。そのPathwayを探索する。
Causes of Carryover	2019年度で、動物実験でマウスの硬膜は予想以上に薄く、必要な細胞数を採取するため、数匹のマウス分の硬膜を一サンプルとして使用することで、余分にマウスが必要となった。さらに、一次スクリーニングの次世代シクエンサーによる網羅的遺伝子発現解析するため、費用が足りないと予想し、前倒しで支払請求した。結局、次世代シクエンサーの解析は間に合わず、その分の費用が残った。2020年度で使用する。