2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of new assay system for on-site analysis targeting hallucinogenic compounds in mushrooms
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19K10697
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| Research Institution | Kobe Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
森田 いずみ 神戸薬科大学, 薬学部, 助教 (20299085)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 典裕 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (90205477)
大山 浩之 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (80572966)
上田 宏 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (60232758)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 抗体 / シロシビン / シロシン / オンサイト分析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
麻薬、覚せい剤など、規制薬物の乱用に係わる問題が深刻化している。その取り締まりに貢献すべく、簡便・迅速で現場への可搬性に優れ、かつ高感度な検出を可能とするオンサイト免疫測定法構築の鍵となる新規抗体の作製を試みた。本研究で開発を目指すシロシビンとシロシンは、幻覚性キノコ成分で、麻薬及び向精神薬取締法で規制される化合物であるが、分子量が小さく、高親和力抗体の調製が極めて難しい。当初の計画に従い、まず、シロシビンに対して特異的な抗体を得るための免疫原を調製した。すなわち、4-ヒドロキシ-N-メチルトリプタミン（4-OH-MT)を出発物質として、3工程でリン酸基を持つカルボン酸に導いたのち、活性エステル法によりウシ血清アルブミン（BSA）と結合させ、リン酸の保護基を除去して目的の免疫原を得た。シロシンについては、さらに分子量が小さく極性官能基に乏しいため、高親和力抗体を得るのが難しい。そこで、同じく4-OH-MTのヒドロキシ基をtert-ブチルジメチルシリル（TBS）基で保護したのち、カルボン酸に導き、脱保護後、活性エステル法によりBSAあるいはスカシガイヘモシアニン（KLH）と結合させた免疫原2種を作製した。さらに抗原性を高めるために分子量を増大させる目的でシロシンにかさ高いTBS基を付加したTBS化シロシンの免疫原2種（BSAおよびKLH結合体）も調製した。得られた免疫原6種をそれぞれA/JマウスおよびBALB/cマウスに投与したのち試験採血を行い、その血清中の抗体価をELISAによりそれぞれ評価し、特に良好な抗体の産生が認められたマウスに最終免疫を行った。得られた脾細胞とNS1細胞とを融合させ、HAT培地で選択培養を行い、限界希釈法によるクローニングを経て、最終的にシロシビンについて3種、シロシンについて3種、TBS化シロシンについて14種の抗体産生細胞株を樹立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り、シロシビンおよびシロシンの免疫原の合成を行った。シロシビン、シロシンのような低分子化合物では、抗体のパラトープとの相互作用点が少ないため、特異性に優れた高親和力抗体の産生は難しい。そこで高親和力抗体を誘導するため、免疫原の工夫を行った。シロシビンはシロシンのリン酸エステルであり、極性官能基を持つため、シロシンより免疫原性を発揮しやすいと期待されるが、特異的な抗体を得るために、リン酸基を未修飾の状態でキャリヤーに結合させた免疫原を調製した。シロシンは分子量がさらに小さく極性官能基に乏しいため、高親和力抗体の産生がさらに難しい。そこで、シロシンそのものに対する抗体産生と同時に、そのフェノール性ヒドロキシ基をTBS化して分子量を増大させた化合物についても抗体を産生させるため、2種類の免疫原を調製した。さらにキャリヤーについても、BSAおよびKLHと種類を増やし、計4種類の免疫原を得ることができた。
得られた免疫原をそれぞれA/JマウスおよびBALB/cマウスに免疫したところ、いずれの免疫原についてもほぼすべてのマウスで期待した免疫応答が認められた。特に良好な抗体の産生が認められたマウスの脾細胞とNS1ミエローマ細胞とを融合させて、HAT培地で選択培養し、限界希釈法によるクローニングを経て、最終的にシロシビンについて3種、シロシンについて3種、TBS化シロシンについて14種の抗体産生細胞株を樹立するに至った。
以上のように、1年目はほぼ期待通りの成果が得られている。
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| Strategy for Future Research Activity |
樹立したそれぞれのモノクローナル抗体について、ELISA系により結合能を評価する。すなわち、シロシビン、シロシンおよびTBS化シロシンに対する親和力や特異性などを評価して、最も優れた抗体種をそれぞれにおいて特定する。特定された抗体を用いて、マジックマッシュルーム中のシロシビンおよびシロシン含有量の測定などを行い、実試料への応用が可能であるか、評価を行う。
得られた抗体の親和力が不足であった場合、「試験管内親和性成熟」により、高親和力抗体への改変を図る。抗体産生ハイブリドーマから抗体可変部 (VH およびVL) の遺伝子をクローニングし、両者をリンカー配列を介して連結して一本鎖Fvフラグメント (scFv) の遺伝子を構築する。Error-prone PCRなどによりランダム変異を加えて多様性に富む変異遺伝子集団を作り、その産物をファージ粒子上に発現させてscFv提示ファージのライブラリーを作製する。そのなかに含まれる高親和力変異scFv提示ファージをパンニングによって選択・単離することで親和力が増大した変異scFvを特定し、その性能の評価を行う。親和力の高い変異体を得ることができれば、より高感度なELISAが可能になるもの、と期待される。
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| Causes of Carryover |
ほとんどの額を使用したが、補助金を有効活用するため、次年度使用額とすることとした。
次年度に必要となる試薬を購入することで、有効に使用する計画である。
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[Journal Article] Seeking high-priority mutations enabling successful antibody-breeding: systematic analysis of a mutant that gained over 100-fold enhanced affinity2020
Author(s)
Oyama Hiroyuki, Kiguchi Yuki, Morita Izumi, Yamamoto Chika, Higashi Yuka, Taguchi Miku, Tagawa Tatsuya, Enami Yuri, Takamine Yuriko, Hasegawa Hanako, Takeuchi Atsuko, Kobayashi Norihiro
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 10
Pages: 4807
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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