2019 Fiscal Year Research-status Report
Wound and repair mechanism in ovariectomized rats with periodontitis -Direct action of estrogen and transition of HSP expression
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19K10862
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| Research Institution | Kanagawa Dental College |
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Principal Investigator |
天野 カオリ 神奈川歯科大学, 大学院歯学研究科, 講師 (70316470)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | OVX / エストロゲン欠乏 / P.gingivalis / 中軽度機械刺激 / β-エストラジオール / C-fos / HSP70 / 唾液腺加齢変化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
口腔組織の細胞は軽度な機械的・物理的刺激により日常的に損傷を受けており、その環境下負傷した状態で死滅せず生存し続ける細胞群の存在についての研究を継続している。
これまでラットを使用してブラッシングなど日常的な機械刺激により歯肉細胞や舌筋細胞の損傷状態を観察し、その中で死滅する細胞の他、負傷した状態で生存し続ける細胞群を確認した（Amano, etal. J.Dent Res Vol 86(8)769-774,2007）。関連研究として歯髄組織にタービンでの極小露髄のような中軽度レベル刺激を与えた場合の歯随細胞の損傷を観察したところ、象牙質露髄直下の歯髄細胞の中で負傷しながら生存する細胞群の存在を確認した。閉経前後世代の女性においては、急速なエストロゲンの減少により生じる種々の疾患や不調に加えて歯周炎のリスクが高くなることが知られている。加えて加齢による唾液腺の線維脂肪化に伴う唾液分泌量減少やエストロゲン欠乏による体内でのカルシウム吸収率の低下に伴い生じる閉経後骨粗鬆症は予防・対応策など近年大きな課題となっている。加えてこの閉経後骨粗鬆症が歯周炎を悪化させる憎悪因子といわれているが、両者の関連についての詳細は未だに不明である。
本研究は卵巣摘出ラットモデル(OVX)を使用して、エストロゲン欠乏環境下でP.gingivalis(PG)にて実験的歯周炎を惹起させ、いわゆる「更年期型歯周炎」の環境を確立し、エストロゲン(βエストラジオール)の投与補充ならびにイソフラボン含有飼料の投与または非投与の環境下で歯肉と舌筋に日常的な機械的刺激としてブラッシングを行った場合の歯周炎組織細胞が受ける損傷レベルと修復過程を観察することを目的とする。最終目標として個々の異なる身体の健康・病的環境下においても臨床的に更年期型歯周炎の予防軽減策として応用する事を検討していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
予備実験として８週齢・卵巣摘出ラットモデルOVX群６匹と偽手術ラットモデルSham群6匹を使用し、普通飼料を与えた。1週間後、実験的歯周炎を惹起させるため4日間、合成抗菌薬を給水瓶にて投与後、供試菌株にはP.gingivalis (PG・ATCC33277継代)の混合菌液を使用し動物用経口ゾンデにて0.5mlを2週間2日おきに計5回塗布、非感染群には5％CMCを塗布し、感染群（PG+）と非感染群（PG-）はそれぞれ隔離して飼育を行った。
約２週間後の11週齢時に深麻酔下で電動歯ブラシ（Braun）を使用し、下顎中切歯間部歯肉と片側舌筋のブラッシングを各1分間（対象群として同個体の上顎中切歯間部歯肉と片側舌を使用）、ブラッシング圧を一定に保持するため、ブラッシング圧計測器（共和電業）を使用して行った。11週齢ラットの体重はOVX群がSham群より平均して18ｇ増量しており軽度な肥満個体もみられた。ブラッシング後15分・3時間後にそれぞれ深麻酔下で4％パラホルムアルデヒドPA/PBS溶液にて潅流固定し、上顎・下顎骨一部を含む歯間歯肉部と舌筋を摘出した。
また、顎下腺と耳下腺も共に摘出した。全ての試料は4％PA/PBS溶液にて24時間再固定後、15％－30％のショ糖溶液に24－72時間浸漬し、7μの凍結切片を作成した。
損傷細胞の標識としてC-fos抗体を、歯周炎のバイオマーカーとしてMMP-8を使用し観察を行った。C-fosならびにMMP-8の発現はOVX・PG(＋)群ブラッシング後15分の歯肉・舌筋細胞共に上皮直下に豊富に認められたが、Sham・PG(＋)群との発現に明瞭な差は認められなかった。またOVX群ラットの顎下腺は肉眼的に明らかな収縮がみられ、さらにHE染色にて観察したところ、OVX・PG(＋)群の腺組織にはSham・PG(－)群と比較して明らかな腺組織の収縮が認められた。
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| Strategy for Future Research Activity |
エストロゲンならびにイソフラボン含有飼料投与群と非投与群における細胞損傷レベルに違いが生じるかを観察するために1．OVXラット＋βエストラジオール投与群2．OVX＋大豆由来イソフラボン含有飼料（オリエンタル酵母）飼育群3．OVX＋普通飼料飼育群4．Sham群（普通飼料飼育）の4群をそれぞれPG(＋)群とPG（－）群に分けて、約６０日後に深麻酔下にてブラッシングを行い、１時間後に４％PA/PBS溶液にて潅流固定を行う。
本研究目的の一つである、エストロゲン欠乏環境下における、軽度機械的刺激による組織の損傷状態について観察を行い、さらに投与されたエストロゲン・イソフラボン含有飼料の存在が、損傷レベルに関与するかについて比較検討する。
予備実験において急性（早期）炎症期における損傷レベルを観察する目的でPG感染後2週間のブラッシングを試行したが、本年度よりエストロゲン欠乏ならびに投与時の両環境における歯周炎の状態や損傷レベルの比較変動観察を加えて慢性期歯周炎環境を設定するために、P.gingivalis感染後６０日の期間経過を追っていく。
また、ストレス応答因子としても認知される、Heat shock protein (HSP)70が加齢に伴うストレスでも誘導されることに加えて、加齢により生じる炎症やストレスを調節する役割を果たすとの報告もあり、エストロゲン欠乏OVX群とβエストラジオール投与補充OVX群におけるHSP70の発現について観察する。
加えて閉経前後世代女性の歯周炎憎悪因子として唾液分泌量の減少が知られており、本実験でHE染色にてOVX群の顎下腺組織に明瞭な収縮が認められたが、PG感染後の一定期間にβエストラジオールの補充ならびに大豆イソフラボン含有飼料を投与した場合、腺組織収縮に改善や変化が起こるのか否か、加えて観察を行う。
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