2019 Fiscal Year Research-status Report
褥瘡に対する細胞療法の確立と創治癒メカニズムの解明に関する基礎研究
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19K10898
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
齋藤 貴史 山形大学, 医学部, 教授 (80250918)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 褥瘡 / 圧迫創 / 炎症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
褥瘡の組織再生研究の基礎データを収集するため、褥瘡モデルの作成を安定化させ、基礎実験として褥瘡の進行メカニズムの一端を解明する研究を行った。褥瘡の発生には、虚血再灌流障害およびそれによって発生する一酸化窒素（NO）が関与していると考えられている。また、糖尿病においては褥瘡の難治化、虚血再灌流障害の悪化が起こることが知られている。糖尿病における褥瘡の進行とNO産生によって受ける影響の関連性については不明である。７週齢雄性SDラットを対照群、糖尿病群の２群に分け実験に供した。褥瘡は、直径10㎜、厚さ10㎜のネオジム磁石にて皮膚を挟んで圧迫（２時間）、解放（２時間）を複数回繰り返すことにより圧迫創として作製することが可能であった。糖尿病の誘発は、ストレプトゾトシンの腹腔内投与によって行い、投与一週間後の血糖値が300mg/dl以上となったラットを糖尿病群とした。対照群、糖尿病群の各々について、圧迫創としての褥瘡の病態とNOの関連性を検討した。初回圧迫前と各圧迫開放時に採血後、血中NOx量を測定した。また各圧迫２時間後に創部皮膚を摘出し、常法に従い組織標本を作製後、光学顕微鏡にて組織学的検討を行った。その結果、組織学的変化は糖尿病群において表皮の菲薄化が顕著となり、創部への炎症性細胞の浸潤が少なく炎症反応の減弱が認められ、また血漿中NOx量は糖尿病群において対照群よりも低値であることが明らかとなった。これらのことから、虚血再灌流障害を有する糖尿病において褥瘡が重症化するメカニズムの一端として、NOの減少を伴う炎症反応の減弱が関与している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
褥瘡モデルを７週齢雄性SDラットにて作成したが良好な圧迫創が作成可能であった。当施設では、従来6週齢の成熟雄性マウス(C57BL/6)にフォーレン吸入麻酔下で腹壁を切開し腹壁部の腹壁に磁石を埋込み、背側皮膚から磁石を設置し縫合し6時間圧負荷をかけて作成しているが、同様の手法で新たにラットモデルが作成できたことで、今後の実験に供する研究モデルに幅ができた。褥瘡の組織再生メカニズムについては不明な点が多い。褥瘡組織の再生を目指した本研究では、圧迫創組織の再生と創傷改善の機序についてまず明らかにすることが重要である。今回、虚血再灌流傷害を来し、創傷治癒を遅延させる病態として、末梢組織でそのような変化を生ずる糖尿病に着目した。糖尿病モデルは膵島細胞に選択毒性を有するストレプトゾトシンを用いて作成したが、実験に供するに十分な耐糖能異常を示した。この虚血再灌流障害が見られる糖尿病モデルにおいては、健常モデルに比し、創部位の表皮の菲薄化と炎症性細胞浸潤の低下による炎症反応の減弱を認め、また一酸化窒素産生量の低下を確認できたことは、褥瘡の重症化メカニズムの一端として、一酸化窒素の減少を伴う炎症反応の減弱があることを示すことができた。本研究の進捗状況は、褥瘡の進行や治癒に係わる基礎メカニズムを明らかにして、次段階として褥瘡の創組織の再生を目指した細胞療法の可能性を検討する過程にある。
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| Strategy for Future Research Activity |
褥瘡の創傷治癒メカニズムには、創部の応力が関係することが示されている。そこで、創傷治癒過程における応力の加減による創傷治癒の程度の相違について明らかにしたい。褥瘡の創傷進行および治癒メカニズムの解明のための基礎研究に加えて、創部組織の再生に係わる研究を行う。6週齢の成熟雄性マウス(C57BL/6)に圧迫創を作成し、創部位に、蛍光発色するGFP導入正常同種マウス脂肪由来幹細胞をシリンジにて局注し幹細胞投与群を作成する。対照として無処置群を作成する。各群について、皮膚組織、皮下組織および深部骨格筋層を含めて切断し、創のサンプリングを行う。幹細胞投与群において、脂肪幹細胞の生着率を蛍光顕微鏡下に評価する。また、創部に定着した脂肪幹細胞を抗GFP抗体により免疫組織学的に同定し、それらに発現する表面マーカーを二重染色にて検討する。そして、褥瘡組織の肉芽形成を含む改善の程度を、幹細胞投与群、無処置対照群の2群間で経時的に比較検討する。また創傷治癒には炎症の消退が深く関与しており、特に炎症抑制的にIL-10産生能を有するM2マクロファージの関与が当施設の先行研究で示されており、上述の2群で採取された組織標本において、M2マクロファージを抗CD163抗体による免疫染色を用いて検出し、炎症の程度とM2マクロファージの浸潤様態を比較検討する。これらにより、褥瘡モデルにおける脂肪幹細胞投与による組織改善効果と創傷治癒メカニズムの一端を明らかにする。また脂肪幹細胞と筋芽細胞の共培養により、各々の細胞内での特徴ある遺伝子発現の増強についてin vitroで検討する。
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| Causes of Carryover |
（理由）追加実験のための研究環境の整備が必要となり、またcovid-19感染の拡がりによる実験環境の停止等が重なり、研究の一部を次年度に予定したため、研究物品の購入が必要となり次年度の使用額が生じた。
（使用計画）新規褥瘡モデルの作成、および血液・生化学検討および病理組織学的検討、増殖再生因子の検討、移植細胞の検討等のため、遺伝子工学用試薬、遺伝子工学用器具、一版薬品、細胞等の消耗品を購入する(618,729円)。研究室環境の維持、データ処理や成果発表に伴う一般文具消耗品、印刷費等を予定する(50,000円）。
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