2020 Fiscal Year Research-status Report
リンパ管網含有立体ヒト皮膚モデルを用いた超音波による新規リンパ浮腫治療法の開発
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19K11318
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
成田 大一 弘前大学, 医学研究科, 助教 (90455733)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
下田 浩 弘前大学, 医学研究科, 教授 (20274748)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | リンパ管ネットワーク / 3次元ヒトモデル / 超音波治療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
リンパ管ネットワークの欠損・破綻に起因したリンパ浮腫に対する新規治療法の確立を目標として，本研究課題では機能的なリンパ管ネットワークを持ったよりヒトに近いin vitroモデルを構築し，このモデルを用いて超音波のリンパ管新生誘導に対する有効性を明らかにすることを目指している。
令和2年度は， Layer-by-Layer (LbL)法を用いることで前年度に確立したリンパ管網含有3次元ヒト皮膚モデルに対する超音波照射のリンパ管新生誘導効果に関する基盤を構築するために，まずは3次元ヒトリンパ管形成モデルに対して超音波を照射してその効果を検証した。
具体的には，細胞外マトリクスナノフィルムコーティングしたヒト線維芽細胞でヒトリンパ管内皮細胞をサンドウィッチ状に積層してリンパ管ネットワークを備えた3次元組織を構築後，超音波（強度:0.3 w/cm2, 周波数:1.5 MHz，頻度:10分/day）を3日間照射した。最後の照射から24時間後に3次元組織を固定・染色し，リンパ管ネットワークの形成を非照射群と比較検討した。
その結果，超音波照射群ならびに非照射群ともに3次元組織全体にLYVE-1（リンパ管マーカー）ならびにCD31（内皮細胞マーカー）共陽性のリンパ管ネットワークが形成されていたが，超音波の照射の有無で明らかなネットワーク形成の違いは認められなかった。
以上の結果から，今後は超音波の照射条件をさらに検証していく必要があると考える。さらに3次元組織は組織構築のために培地にウシ胎児血清などの種々の液性因子が影響する可能性があるため，よりシンプルな単層培養系で超音波の照射条件を検証していく必要があると考える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
令和2年度は令和元年度に確立したリンパ管網含有ヒト皮膚モデルへの超音波照射における基盤構築のため，リンパ管ネットワークを備えた3次元組織に対する超音波の照射を行った。その結果，超音波照射の有無におけるリンパ管ネットワークの形成に明らかな違いは認められなかった。そのため，今後は超音波の照射条件を変えるなどのさらなる検証が必要になる。また，3次元組織構築には培地にウシ胎児血清を添加するため，液性因子の影響が強く，物理刺激のみの変化を捉えるにはさらに培養環境を検証する必要があると考える。これらを検証する必要があるため，現時点では研究がやや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度は，まずはヒトリンパ管内皮細胞の単層培養系を用いて実験を実施し，超音波の照射条件を絞り込むとともに，その単層培養下でのリンパ管内皮細胞の形態と分子制御機構に対する効果を免疫組織化学やWestern blottingなどを用いて明らかにする。また3次元培養組織の細胞外マトリクスならびに培地などの培養環境の検証を実施し，超音波のリンパ管ネットワーク形成に関する効果を検証していく。
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| Causes of Carryover |
【理由】令和2年度は令和元年度に引き続き，新型コロナウイルスにより参加予定であった学会（日本リンパ学会（埼玉県さいたま市），日本解剖学会（愛知県名古屋市））がオンラインでの開催となったため旅費の余剰金が生じた。
また，超音波治療器は代替機を使用することができたため，本体購入の余剰金が生じた。
【使用計画】引き続き研究を推進するために必要な細胞培養器具，培地ならびに細胞などを購入するとともに実験系の変更に伴う超音波照射可能な環境をそろえていく。また，学術集会への旅費ならびに組織標本解析のための試薬の購入費として使用する。
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