Does moderate voluntary exercise have any prevent effect on inflammatory bowel disease ?

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K11474
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 松本 綾子 順天堂大学, 大学院スポーツ健康科学研究科, 特任助教 (20833825)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 飯泉 恭一 柴田学園大学, 生活創生学部, 准教授 (30439351) ; 川崎 広明 昭和女子大学, 生活科学部, 講師 (40531380) ; 棗 寿喜 東海大学, 医学部, 特任助教 (90761841)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 炎症性大腸炎 / 自発運動 / 酸化ストレス / ニトロトリプトファン

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、運動による炎症性大腸炎(IBD)の予防効果とその仕組みを、IBD誘発マウスを材料に、タンパク質レベルで解明することである。
初年度、2年目と、運動によるIBDの予防効果を期待して、IBD誘発剤であるデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を含む飲水量を制限するなどIBD誘発の方法を修正しながら研究を進めてきたが、予想に反して、運動による明らかな炎症抑制効果は認められなかった。そこで、3年目にあたる本年度は、当初の計画を変更して、IBDの誘発によって、どのようなタンパク質が発現変動し、翻訳後修飾を受けるかを、運動をさせていないマウス（非運動群）で網羅的に調べることとした。
まずは、非運動群（C57BL/6、10週齢、雄性）に、DSS濃度0、2、3、4 %の条件（各群5個体以上）でIBDを誘発した。5日間のDSS投与から8日目に大腸を採取し、これまでと同様の方法で、体重変化、糞の状態（下痢・血便有無のスコア）、腸管長の短縮、サイトカインなど炎症マーカー（TNF-α、IL-1β、IL-6など）のmRNAの発現量を指標に炎症の評価を行った。その結果、DSS濃度依存的に炎症の憎悪が認められた。しかし、一部の指標では4%での頭打ちの現象がみられた。そこで、0、2、3%の条件でIBDを誘発したマウスから採取した大腸を用いて、プロテオーム解析を進めることにした。現在、翻訳後修飾の解析に使用するリン酸化抗体の選別や二次元電気泳動をはじめとした解析手法の確立など予備実験を進めている。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

初年度には、当初の予想に反して、運動群による炎症の悪化が示唆された。これは、運動群と非運動群で、IBD誘発剤であるDSSを含む飲水量に有意な差が生じた結果と推測された。そこで2年目には飲水量を制限して再度IBDの誘発を行った。IBDに対する運動効果は、初年度同様、体重変化、糞の状態、腸管の短縮、サイトカインなど炎症マーカー（TNF-α、IL-1β、IL-6など）のmRNAの発現量変化を指標に行った。その結果、運動群での炎症憎悪はなくなったものの、運動による顕著なIBD抑制効果も観察できなかった。さらに、腸管長にも有意差が見られず、運動の有無によるタンパク質の発現量の差は極めて小さいと予想された。そこで、高感度かつ網羅的に発現量を調べる必要があると判断し、当初の予定になかったmRNAを用いたマイクロアレイ解析を行った。その結果、運動のみ、DSSのみで発現が変化する遺伝子の多くが両者で共通していることが明らかとなった。また、運動群と非運動群で、DSSに対する発現量に差が見られる遺伝数が予想以上に少なく、また、その発現量自体も差が小さかった。よって、運動の有無によるタンパク質の量的、質的な変化を調べるという当初計画のままでは、運動によるIBD抑制効果に繋がるタンパク質同定は困難であると判断した。そこで、まずはIBDの誘発により、どのようなタンパク質が発現変動し、翻訳後修飾を受けるかを網羅的に調べることにした。
再度、運動をさせていないマウスで、DSS濃度を0%、2%、3%、4%と変化させIBDを誘発して、大腸を採取し、IBDの指標となる様々なデータを一から取り直す必要があったため、本年度だけでは十分なタンパク質レベルの解析には至らなかった。以上から、研究進捗状況を遅れていると判断し、本研究の期間延長申請を行った。

Strategy for Future Research Activity

本研究の目的は、運動によるIBDの予防効果とその仕組みをタンパク質レベルで解明することである。本研究は当初3年間を計画しており、初年度、2年目と、運動によるIBDの予防効果を期待してIBD誘発の方法を修正しながら研究を進めてきたが、予想に反して、運動による明らかな炎症抑制効果は認められなかった。そこで、3年目にあたる本年度は、当初の計画を変更して、IBDの誘発によって、どのようなタンパク質が発現変動し、翻訳後修飾を受けるかを、運動をさせていないマウスで網羅的に調べることとした。
まずは、運動をさせていないマウスに、DSS濃度0、2、3、4 %の条件でIBDを誘発し、これまでと同様の様々な指標でIBDを評価し、DSS濃度依存的に炎症憎悪が見られることを確認した。今後は、プロテオーム解析を中心に研究を進める予定である。SDS-PAGEや二次元電気泳動、また、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動で、DSS濃度依存的に発現量が変化するタンパク質を同定すると同時に、抗体や修飾部位特異的な蛍光色素を用いて、ニトロ化、リン酸化など翻訳後修飾に変化が見られるタンパク質の同定を目指す。さらに、質量分析器を用いて変動の見られたタンパク質の特定を行う。
これらの結果を踏まえ、改めてタンパク質レベルから運動の有無による影響を調べることで、運動のIBD抑制に対する影響を考察する予定である。

Causes of Carryover

本研究は当初3年間の予定で、初年度には運動によるIBD抑制効果を確認し、次年度には採取した大腸を材料にタンパク質レベルの解析を進める計画であった。しかし、初年度の研究では、運動の有無でDSSを含む飲水量に差が生じ、マウス体内に取り込まれるDSS量に有意な差が生じたことで、運動群で炎症が憎悪するという想定外の結果となった。そのため、2年目には、飲水量を制限し取り込まれるDSS量を揃えて再実験を行ったが、その結果も予想に反したもので、運動によるIBDの顕著な抑制効果は観察されなかった。そこで、当初の計画を変更して、まずはIBD発症に関係するタンパク質を網羅的に調べることとし、新たに運動をさせていないマウスで解析を一からやり直したが、タンパク質レベルの解析までには至らなかった。よって、研究費の未使用分は、次年度の研究に必要なタンパク質解析試薬やキット購入に充てる予定である。