2020 Fiscal Year Research-status Report

成長ホルモンの分子量の違いを利用した新しいドーピング検査法の開発

Research Project

Project/Area Number	19K11530
Research Institution	Nippon Medical School
Principal Investigator	石川真由美日本医科大学, 医学部, 講師 (60398831)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	石川隆紀大阪市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (50381984)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	成長ホルモン / スポーツ / 毛髪 / ドーピング検出方法
Outline of Annual Research Achievements	成長ホルモン(GH)には筋量を増加させるという作用があり、近年、ドーピングに使用されている。が、体内に存在する内因性ホルモンのためにその検出が難しかった。GHには分子量が異なるいくつかのVariantがあり、それぞれが決まった比率で血中に存在している。外部からのGH投与があると、これらのvariantのGH全体に占める割合が変化する。例えばいくつかあるvariantの一種で分子量20,000のGH(20K-GH)は、血中のGHの約6％を占め、GH産生に占める割合も一定の割合で、正常の状態ではほとんど変化がない(Ishikawa M, et al. J Clin Endocrinol Metab. 84: 98-104, 1999.　Tsushima T, et al. J Clin Endocrinol Metab. 84: 317-322, 1999.)。本研究ではこの特性を生かし、試料を毛髪とすることで数ヶ月前のGHのドーピングや長期の休薬があっても検出できる新しいドーピング検査方法の開発を目的とした。頭髪は侵襲なく採取でき、一か月に1cmほど伸長することから、毛根部から1cm刻みで頭髪を切断し、各部位を解析することで、1か月ごとの薬物摂取歴を分析することが可能である。体内に取り込まれた外部からの薬物は、毛乳頭に入り込んだ毛細血管部を介して毛根部に移行し、メラニン色素と結合して毛髪内部に蓄積するとされている（木倉瑠理、他。国立医薬品食品衛生研究所報告　116: 30-, 1998. H.Kimura, et al. J Anal Toxicol 23:577-, 1999.）。我々は昨年度にひきつづき、質量分析計（X500R QTOFシステム、Sciex社）を用いて頭髪からの成長ホルモンの検出と抗体を用いて毛根部を含んだ頭髪の免疫染色を試みた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 昨年度、下垂体を用いて、GHが質量分析計（X500R QTOFシステム、Sciex社）で検出できるかを検討したところ、下垂体からはGHの検出が可能であった。そこで正常人の頭髪を試料としてGHが質量分析計で検出できるか検討したところ、ケラチンが多く、検出ができなかった。次に、毛髪を叩くことでケラチンの多い外側の毛皮質、毛小皮を取り除き、毛根の毛髄質部分から質量分析計でGHの検出を試みたが、やはりケラチンが多く、検出ができなかった。また昨年度に引き続き、頭髪の免疫染色を行った。その方法は、上記と同様に毛髄質部分を取り出し、抗GH抗体にて免疫染色を行なった。その結果、抗GH抗体に陽性の部分が認められた。抗20 K-hGH抗体（Monoclonal Antibody anti-human growth hormone 20K (hGH-20K) 、# HGH-33、Inycom Biotech）を用いて検討したが、その後、この抗体が発売中止となり、他に20K-GHに特異的な抗体がなく、現在、20K-GHに特異的な抗体の作成を試みている。
Strategy for Future Research Activity	GHには分子量5 kilodalton、17 kilodaotonといった他のvariantも存在している。これらは外部から投与された22K-GHと比較して分子量に大きな違いがあり、こういったサイズのGHが質量分析計で検出できるか検討を行う予定である。また20K-GHに特異的な抗体の作成を検討中である。さらに被験者のGHやインスリン用成長因子-I(IGF-I)測定をおこなう予定であり、それには今年度購入したプレートリーダーを使用する。
Causes of Carryover	頭髪の質量分析が、ケラチンが多いことなどが理由に進展しなかった。また免疫染色に関しては、前年度購入した抗体を用いて行ったが、条件設定などに時間がかかり、本格的な免疫染色には至らなかった。さらに購入した抗体の販売中止があり、次年度は抗体の作製も必要な状況であるため。