骨格筋細胞の分化運命を可視化するシステムの構築

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K11540
• Research Institution: Mukogawa Women's University
• Principal Investigator: 山添 光芳 武庫川女子大学, 健康・スポーツ科学部, 教授 (00284745)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 骨格筋細胞 / 分化運命 / 速筋 / 遅筋 / ゲノム編集 / 蛍光蛋白質

Outline of Annual Research Achievements

骨格筋繊維には大きく分けて、収縮力・易疲労性の異なる速筋繊維と遅筋繊維がある。ヒトでは1つ1つの筋肉に異なるタイプの筋繊維が混在しており、例えばヒラメ筋には遅筋が多く含まれているが足底筋には速筋が多いなど、筋肉によって構成も異なる。また同じ筋肉でも分布の比率に個人差があると言われている。さらに加齢によっては、速筋の方が減少しやすいと言われており、サルコペニアの一因となっている。筋繊維が分化するときに、どのような因子によってどちらの筋繊維に分化するのかが決定されるのか、またどのような因子が筋繊維タイプの相互変換を促すのかについては、詳細なメカニズムは明らかにされていない。これらを解明することは、高齢者のサルコペニアを防止したり、効率的なスポーツトレーニングを行うための一助となりうる。
そこで、細胞を生かしたまま経時的に解析するために、筋繊維の状態を異なる蛍光蛋白質の発色で見分ける方法を考えついた。性質の異なる筋繊維に含まれるミオシン重鎖蛋白質の片方の遺伝子座に、色の異なる蛍光蛋白質の遺伝子をノックインしておけば、蛍光の発色の違いによって筋繊維の状態が把握できる。狙った遺伝子座に思い通りの蛍光蛋白質遺伝子を挿入するためには、近年注目されているCRISPR-Cas9を利用したゲノム編集技術を採用することにした。
ゲノム編集を行う準備として、それぞれのミオシン重鎖蛋白質の遺伝子の上流部分と下流部分を両側に持つ蛍光蛋白質遺伝子をターゲッティングプラスミドとして構築しなければならない。
2021年度はこれまでに引き続き、ターゲッティングプラスミドの構築を行ってきた。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

マウスの遅筋、速筋、中間の性質を持つ3種類の筋肉繊維を構成するミオシン重鎖蛋白質の遺伝子を同定し、それぞれの遺伝子座に異なる発色の蛍光蛋白質の遺伝子をノックインしようとしている。この目的のためにそれぞれの遺伝子座へのターゲッティングプラスミドを作製しているが、それぞれのミオシン重鎖蛋白質の遺伝子がファミリーを形成して酷似していることもあり、完全に完成したものはまだ得られていない。

Strategy for Future Research Activity

未完成のターゲッティングプラスミドを完成させる。完成したターゲッティングプラスミドから、マウス筋芽細胞C2C12への導入を行い、ゲノム編集が完了したクローンを選択する。また遺伝子のノックインは、CRISPR-Cas9を使ってもノックアウトに比べて効率が低いと言われている。そこでこれを改善するために、ターゲッティングプラスミドから一本鎖のDNAを調製し相同組み換えを起こす方法を試してみる。
また昨年度の目標にしていたマンパワーを補うための実験補助員は、適当な人材がなかった。引き続き、人材確保を行う予定をしている。

Causes of Carryover

「現在までの達成度」で述べたように、ターゲッティングプラスミドが完成しなかったので、試薬の購入はあまり必要なかった。その代わりに、老朽化したPCRマシンを新調した。今年度は、科研費研究で使用する細胞保存のための液体窒素タンクの更新に、予算を一部使用する予定である。