骨格筋細胞の分化運命を可視化するシステムの構築

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K11540
• Research Institution: Mukogawa Women's University
• Principal Investigator: 山添 光芳 武庫川女子大学, 健康・スポーツ科学部, 教授 (00284745)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 骨格筋細胞 / 速筋 / 遅筋 / 分化運命 / ゲノム編集 / 蛍光蛋白質

Outline of Annual Research Achievements

骨格筋はその特性によって遅筋繊維と速筋繊維に分類される。遅筋は、持久力を重視した長時間の活動に適した筋肉で、酸素を効率的に利用し持久力を発揮することができる。例えば、マラソンなどの有酸素運動に適した筋肉とされている。一方速筋は、短時間で高い力を発揮することに特化した筋肉で、瞬発力や筋力を発揮するために使用されている。速筋はスプリントや重量挙げなどの短時間の高強度運動に適している。筋肉は通常、遅筋繊維と速筋繊維の組み合わせで構成されており、個々の筋肉の割合や特性は個人やトレーニングの影響を受ける。
筋肉の遅筋と速筋の分化メカニズムは、神経系からの信号と筋肉細胞内の遺伝子発現制御によって調節される。そこで様々な刺激によって分化がどのように制御されているのかを明らかにするために、各タイプの筋繊維を固定せずに生かしたままで色で識別するシステムの構築を目指している。
速筋と遅筋はミオシン重鎖のタイプの違いが最も顕著であり、筋肉の収縮速度や特性に大きな影響を与えている。そこで特異的なミオシン重鎖の遺伝子座に色の異なる蛍光蛋白質遺伝子をゲノム編集技術によってノックインし、筋繊維の状態を可視化しようと計画している。
これまでの期間を使ってノックイン用のターゲッティングプラスミドの構築を行ってきたが、ミオシン重鎖遺伝子がファミリーを作っているなどの理由で作製に苦労してきた。今回目的とするプラスミドの候補が1つ出来たので、マウス筋芽細胞C2C12に導入を予定している。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

タイプの異なる3種類のミオシン重鎖の遺伝子座を同定し、ゲノムの一部をPCRで増幅して得られたDNA断片をターゲッティングプラスミドの上流と下流のアームにした。その際にPCRで複数の断片が増幅されたものがあり、ミオシン重鎖遺伝子がファミリーを作っているためと考えられた。これに関してはPCRの条件を変えたり、プライマーの再設計を行った。その中で今回目的とするプラスミドの候補が1つ出来たので、ゲノムへのターゲッティングを予定している。

Strategy for Future Research Activity

ターゲッティングプラスミドをCas9蛋白とガイドRNAと共にマウス筋芽細胞C2C12へ導入し、ノックインを行う。ゲノム編集による通常のノックアウト操作より効率が低いことが予想されるので、その場合はターゲッティングプラスミドから調製した一本鎖DNAに使用を試みる。また最初は薬剤選択マーカーを含まないターゲッティングベクターで試してみるが、ターゲッティング効率が低い場合は薬剤選択マーカーをターゲッティングベクターに加える。
万が一両方の対立遺伝子にノックインされてしまう場合は、Cas9蛋白の量を調整して片方の対立遺伝子にのみ蛍光蛋白質遺伝子がノックインされるようにする。
残念ながらマンパワーの不足は解消できていない。一つの原因は研究者が所属する学部に生命科学の実験に興味のある学生がいない事があげられる。即戦力となる人材を確保するために、当大学の薬学部や食物系の学部の学生からも広く人材を募りたい。

Causes of Carryover

「現在までの進捗状況」に報告したように、コロナ禍の影響で当初の計画より遅れてしまったため、試薬等の消耗品の購入はあまり必要としなかった。その代わりに細胞を凍結保存するための液体窒素タンクが、使用開始から10年以上経ち動作が不安定になってきたため、液体窒素の自然蒸発量が少なくコンパクトなものに新調した。今年度は細胞培養に必要な液体試薬を作製するための、コンパクト型超純水製造装置の購入に予算の一部を使用する予定である。