2019 Fiscal Year Research-status Report
ミトコンドリア呼吸鎖超複合体へのコエンザイムＱ１０輸送機構の解明
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19K11778
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| Research Institution | Tokyo University of Technology |
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Principal Investigator |
加柴 美里 東京工科大学, 教養学環, 教授 (80338186)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
和田 裕雄 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 専任准教授 (50407053)
亀田 貴寛 東京医科歯科大学, 医歯学総合研究科, 助教 (80758558)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | コエンザイムQ10 / ミトコンドリア呼吸鎖超複合体 / 加齢 / プロサポシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
加齢に伴いミトコンドリアの呼吸機能が低下するが，その原因は不明である．ミトコンドリア電子伝達系タンパク質群は,それぞれ独立ではなく超複合体を形成して存在している．CoQ10も本超複合体に含まれて存在している．CoQ10の組織内濃度は，加齢に伴い減少することが報告されている．しかしながら，これらのデータは細胞レベルや細胞小器官レベルトータルでのCoQ10量を解析したものであり，ミトコンドリア電子伝達系の真に電子を伝達している部位のCoQ10量や本部位へのCoQ10輸送量が加齢により変動しているのかは不明である．本研究の目的は，ミトコンドリア呼吸鎖超複合体へいかにCoQ10が輸送されるのか，そして，それが加齢によりいかに変動するかの解明である．
脂質を必要場所に適切に輸送するには，脂質と結合して輸送するタンパク質の存在が必要不可欠であると考える．我々は，CoQ10と結合してこれを可溶化するタンパク質としてサポシンBとその前駆体タンパク質プロサポシンを見出してきた.また，ミトコンドリア呼吸鎖超複合体中のCoQ10量を半定量する手法を確立した．
これらの知見をもとに研究初年度は，下記検討を行った．
①プロサポシンノックダウン株を樹立し，本細胞株のミトコンドリア呼吸鎖超複合体中のCoQ10量測定の準備を行った．研究初年度の本年度はノックダウン株作成の確認と，ノックダウン中のCoQ量の解析を行った．
②呼吸鎖超複合体中へのCoQ10の輸送速度を解析する目的で，呼吸鎖複合体中のCoQ10欠乏細胞モデルの作成を行った．具体的には，細胞にCoQ10合成阻害剤である4-ニトロ安息香酸投与し，CoQ10欠乏細胞モデルを作成した．本細胞モデル中のミトコンドリア呼吸鎖超複合対中のCoQ10量を解析したところ，その低下を確認した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
CoQ10欠乏細胞モデルと，そのCoQ10測定については順調にすすんでいる．しかしながら，呼吸鎖超複合体での解析の精度を向上させる目的で，ウエスタンブロッティングによる確認実験も追加すべく準備も開始しており，結果，予定していた動物実験への着手がおくれている．
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| Strategy for Future Research Activity |
本実験計画は，下記2つの実験系からなる。それぞれの実験系毎に、次年度の方策を記す。
①細胞培養系での検討：プロサポシンが呼吸鎖超複合体へCoQ10を輸送するタンパク質であるか否かを引き続き確認する．実験手法としては，本年度細胞の樹立をおこなったプロサポシンノックダウン株のミトコンドリア呼吸鎖複合体分画中のCoQ10を解析する．ミトコンドリア呼吸鎖超複合体中のCoQ10量は，ミトコンドリアタンパク質をブルーネイティブ電気泳動手法にて分離し，インゲルアッセイにて超複合体分画の位置を確認した後，ゲルを切り出す．切り出したゲルからヘキサン抽出手法によりCoQ10を抽出し，HPLC-ECDにて定量する．また，さらには，CoQ10合成阻害剤添加後，CoQ10合成を再開させ，その際の呼吸鎖超複合体中へ のCoQ10の輸送速度を解析する．本測定系についても，すでに初年度にCoQ合成阻害剤添加による細胞モデルの樹立と本細胞モデルの呼吸鎖超複合対中のCoQ10量の測定を終えているので，次年度は実際にCoQを投与した際の挙動の解析に着手する．
②加齢によるミトコンドリア呼吸鎖超複合体へのCoQ10挿入量の変動の解析：加齢動物のミトコンドリアの解析を行う．加齢モデル動物としては，老齢 正常マウス（1年齢，1.5年齢，2年齢）や早老症モデルマウスを使用する．早老症モデルマウスとしてはKlothoマウス（Clea Japanより購入予定）やSAMマウス（SAM研究協議会に譲渡依頼予定）の使用を予定している．さらには高齢者の末梢血白血球を用いてミトコンドリア呼吸鎖超複合体中のCoQ10量を解析する．
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由：動物実験の開始が遅れており，動物実験準備費用が未使用のため．次年度，本解析を行う際に使用予定．
使用計画：本実験計画は，下記2つの実験系からなる。それぞれの実験系毎に、使用計画を記す。
①細胞培養系での検討：プロサポシンが呼吸鎖超複合体へCoQ10を輸送するタンパク質であるか否かを引き続き確認する．細胞培養関連費用、電気泳動費用、HPLC-ECDに用いるエルエント費用として使用する。
②加齢によるミトコンドリア呼吸鎖超複合体へのCoQ10挿入量の変動の解析：加齢動物のミトコンドリアの解析を行う．加齢モデル動物としては，老齢 正常マウス（1年齢，1.5年齢，2年齢）や早老症モデルマウスを使用する．早老症モデルマウスとしてはKlothoマウス（Clea Japanより購入予定）やSAMマウス（SAM研究協議会に譲渡依頼予定）の使用を予定している．さらには高齢者の末梢血白血球を用いてミトコンドリア呼吸鎖超複合体中のCoQ10量を解析する。実験動物費用とその維持費用を予定している。
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