2020 Fiscal Year Research-status Report
Development of a prediction method for cofactors binding to uncharacterized enzymes using feedback from experimental validations
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19K12211
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| Research Institution | Nagahama Institute of Bio-Science and Technology |
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Principal Investigator |
塩生 真史 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 准教授 (30345847)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
土方 敦司 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, プロジェクト特任講師 (80415273)
向 由起夫 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 教授 (60252615)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 機能予測 / 酵素 / 機械学習 / 出芽酵母 / ピリドキサールリン酸 / 低分子結合予測 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. ピリドキサールリン酸（PLP）結合タンパク質をモデルとしたProLMSの改良と他の補酵素への拡張
2019年度に開発した3次元畳み込みニューラルネットワークを用いた低分子リガンド予測法（ProLMS-3DConv）によるPLP結合残基の予測精度の評価を行ったところ、2019年度以前から開発してきた低分子リガンド予測法（ProLMS）と同程度の的中率だった。この結果から、まずPLPに結合する残基を予測し、その結果に基づいてタンパク質のPLP結合能を予測する方法では予測精度を向上させることが難しいと判断した。そこで方針を変更し、グラフニューラルネットワークを用いた低分子リガンド予測法（ProLMS-GNN）の開発を行った。ProLMS-GNNは、ProLMSと同様の特徴量を用いるが、PLP結合残基を予測できるだけでなく、PLP結合能も直接予測できる。ProLMS-GNNの予測精度を評価したところ、PLP結合残基の予測でもPLP結合能の予測でもProLMSと比べて大きく改善していた。また、PLP以外の補酵素との結合を予測するモデルの構築も開始し、FADについての予測モデルを構築した。
2. 出芽酵母プロテオームに対するPLP結合予測と実験的検証
鋳型とするタンパク質立体構造情報を更新して出芽酵母プロテオームのホモロジーモデリングを再度行い、ProLMS-GNNによりPLP結合予測を行うことができるタンパク質の構造情報を増やした。また、GSTタグを用いたアフィニティ精製により得られた精製タンパク質を用いたPLP結合アッセイ系の条件検討を行った。PLPの定量には、ビタミンB6要求性酵母株を用いた微生物定量法を利用した。その結果、既知のPLP結合タンパク質においてPLPの結合量を求めることができ、ビタミンB6微生物定量法がPLP結合アッセイに利用できることがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1. PLP結合タンパク質をモデルとしたProLMSの改良と他の補酵素への拡張
本研究課題開始時の研究計画では、3次元畳み込みニューラルネットワークをProLMSに組み込むことでPLP結合残基予測の的中率を向上させることを目指していた。しかし、実際に構築したProLMS-3DConvによるPLP結合残基の的中率は従来のProLMSと同程度にしかならず、計画とは異なる方法でPLP結合能を予測する必要があることがわかった。そこで、2020年度はグラフニューラルネットワークで特徴量を学習させるProLMS-GNNを開発し、PLP結合残基だけでなく、PLPとの結合能を高い精度で予測することができた。また、PLP以外の補酵素についても予測モデルを構築する計画だったが、実際にFADについてProLMS-GNNによる予測モデルを作ることができた。
2. 出芽酵母プロテオームに対するPLP結合予測と実験的検証
PLP結合予測の実験的検証をするためのPLP結合アッセイ系について条件検討を行い、ビタミンB6微生物定量法を利用したPLP結合アッセイ系を確立することができた。一方で、ProLMS-GNNの開発に時間がかかったため、ProLMS-GNNを使って出芽酵母プロテオームにおけるPLP結合の予測を行うまでには至らなかった。
以上のことから、ProLMSの改良は計画通りではないもののおおむね順調に進展しているが、出芽酵母プロテオームに対するPLP結合予測は計画よりやや遅れているため、総合的に見て「やや遅れている」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. PLP結合タンパク質をモデルとしたProLMSの改良と他の補酵素への拡張
2021年度はPLPおよびFAD以外の補酵素についてProLMS-GNNによる予測モデルを構築し、様々な補酵素の結合が予測できるようにする。また2020年度はProLMS-GNNの開発に注力したため、2019年度に開発したリガンドドッキングに基づく低分子相互作用部位の予測法についてはあまり進展させることができなかった。2021年度は学部生をアルバイトとして雇用することでこの低分子相互作用部位予測法の開発を進め、ProLMS-GNNを補完する方法とする。
2. 出芽酵母プロテオームに対するPLP結合予測と実験的検証
2020年度にホモロジーモデリングにより得られた出芽酵母タンパク質のモデル構造に対してProLMS-GNNを適用し、PLP結合能が予測される出芽酵母タンパク質を求める。その中からPLPとの結合が注釈付けされていないものを選定してGST融合タンパク質を設計し、発現・精製を行った後にビタミンB6微生物定量法もしくはフェニルヒドラジン法を用いたPLP結合アッセイ系を使ってPLP結合能を確認する。アッセイの結果が陰性だった場合に、予測が間違っている場合だけでなく、精製したGST融合タンパク質がPLPを結合できる立体構造を形成できていない場合もある。特に多量体で機能するタンパク質の場合、GSTタグにより複合体が形成できない可能性がある。そこでアッセイを行うタンパク質の選定の際は、予測されたPLP結合能の信頼度に加えて、複合体を形成するかどうかも考慮する。複合体を形成すると考えられるものについては、GSTタグが複合体形成に与える影響をモデル構造に基づいて評価し、影響しにくいと考えられるタンパク質を優先する。
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| Causes of Carryover |
参加した学会がオンライン開催となったために計上していた旅費を使用しなかったり、当初の計画には無かった学部生を雇用したりするなど、使用用途を大きく変更した。残額は次年度に交付される経費と合わせて使用した方が良いと判断した。
生じた次年度使用額は、データ整理、及び、プログラム作成のために学部生を雇用する際の謝金として使用する。
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| Remarks |
ProLMSで用いている特徴量の一つである低分子との結合傾向値をデータベース化して公開している。
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Research Products
(2 results)
