• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to project page

2019 Fiscal Year Research-status Report

線量率効果におけるアセチル化シグナルの多様性とエピジェネティクス制御

Research Project

Project/Area Number 19K12321
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

井倉 正枝  京都大学, 生命科学研究科, 研究員 (40535275)

Project Period (FY) 2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords線量率効果 / アセチル化シグナル / 多様性 / エピジェネティクス / TRRAP
Outline of Annual Research Achievements

放射線の生物学的効果で、極めて興味深い現象の一つに線量率効果がある。同一の吸収線量であるのに、その線量率の違いで生物学的効果が、なぜ大きく異なるのか、その違いを生み出す分子基盤については未だ不明な点が多い。本課題では、TIP60などアセチル化酵素複合体の構成因子であるTRRAPに着目し、TRRAPを介したアセチル化シグナルとH2AXのリン酸化の連携システムの違いを明らかにし、線量率効果の違いを見定める分子基盤を構築することを目的とする。本年度は、高線量率と低線量率でH2AXのリン酸化に対するATMとDNA-PKcsの優位性が異なり、高線量率では、主にATMが、一方、低線量率では、DNA-PKcsが、H2AXのリン酸化を担うことを示唆する結果をもとに、まずはTRRAPのノックダウン細胞、そしてアセチル化を阻害した細胞におけるGFP-DNA-PKcs発現細胞を用いてDNA-PKcsのDNA損傷領域での挙動についてFRAPとmicro-irradiation法を用いて検討した。先行研究により、DNA-PKcsは、DNA損傷部位への結合と離脱を繰り返す、ダイナミックな挙動を示すことが知られており、このダイナミックな挙動は、正確なDNA修復反応に必要であることが報告されている。今回、TRRAPのノックダウン細胞、およびアセチル化を阻害した細胞においてGFP-DNA-PKcsのDNA損傷部位へのダイナミックな結合が抑制されることが明らかになった。またこのDNA-PKcsのダイナミックな挙動は、DNA-PKcsの自己リン酸化に依存することが知られていたが、我々の見出したTRRAPを介したDNA-PKcsのダイナミックな挙動は、このリン酸化には依存しないことが示され、DNA-PKcsの新たな制御機構の存在が示唆された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、FRAPとmicroirradiationを組み合わせた単一細胞におけるGFP-DNA-PKcsの挙動を観察することが可能になった。これまではYFP-DNA-PKcsを用いた実験を行なっていたが、我々の使用している顕微鏡の感度では、FRAP解析に困難を伴っていたため、タグをGFPに変更した。このことにより格段に感度が上がったことで、良好な結果を得ることができるようになった。また、CRISPR-CAS9のシステムによるクロマチン免疫沈降法を立ち上げ、DNA-PKcsのDNA損傷領域への集積を確認した。さらに、TRRAPのノックダウンおよびTIP60によるH2AXのアセチル化の阻害によるGFP-DNA-PKcsの挙動の抑制をクロマチン免疫沈降法によっても検証することができた。今回、PCAFとGCN5について、線量率の違いによってTRRAPとの結合に違いが見られるか否かの実験は、遂行することができなかった。次年度で展開したい。

Strategy for Future Research Activity

今後は、本年度に遂行できなかったPCAFとGCN5に関して、異なる線量率でTRRAPとの結合に違いが見られるか否かの実験を行うと共にGFP-DNA-PKcsを発現させた野生型およびTRRAPのノックダウン細胞に低線量率放射線照射(1.33mGy/min, total 3Gy)および高線量率照射を施して、FRAPを用いたバイオイメージング解析で比較検討する。さらにCRISPR-CAS9システムによるクロマチン免疫沈降法を用いて、線量率の違いによってDNA-PKcs及びATMのDNA損傷部位への結合能の違いを野生型およびTRRAPのノックダウン細胞で比較検討する。さらにこれらの知見を元に異なる線量率でアセチル化シグナルを阻害した時に、変異率にどのような影響をもたらすのかについてHPRT遺伝子の変異原解析を行い検証して行く予定である。この結果を元に同条件でcolony formation assayを遂行し、低線量率放射線障害におけるがん化シグナルへの影響も合わせて解析していく。

Causes of Carryover

本年度のクロマチン免疫沈降法による解析やウェスタンブロッティングで使用していた抗体が、製造中止となり、ほかの抗体について検討したが、良好な結果を得ることができず、急遽、自前で抗体を作製する必要が生じた。またクロマチン免疫沈降に使用できる抗体の力価が、使用予定の抗体では、賄うことが不可能である可能性が生じ、別の抗体での検討のための予算の確保が必要となった。これらの事情により次年度に繰り越した。

  • Research Products

    (6 results)

All 2019

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (5 results) (of which Invited: 2 results)

  • [Journal Article] Epigenetic interplays between DNA demethylation and histone methylation for protecting oncogenesis.2019

    • Author(s)
      Kanji Furuya,Masae Ikura,Tsuyoshi Ikura
    • Journal Title

      J. Biochemistry

      Volume: 165 Pages: 297-299

    • DOI

      10.1093/jb/mvy124

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] ロジスティックモデルの更新:老化研究における新たな視点2019

    • Author(s)
      古谷寛治、井倉正枝、井倉 毅
    • Organizer
      日本遺伝学会第91回大会
    • Invited
  • [Presentation] 細胞の生き残り戦略:ゲノムストレス応答蛋白質間相互作用の揺らぎ2019

    • Author(s)
      井倉 毅、古谷寛治、白木琢磨、井倉正枝
    • Organizer
      第92回日本生化学会大会
    • Invited
  • [Presentation] オートファジー機構によるがんシグナル経路の調節2019

    • Author(s)
      古谷寛治、井倉正枝、井倉毅
    • Organizer
      日本放射線影響学会第62回大会
  • [Presentation] ロジスティックモデルの更新に伴う老化研究の新たな視点2019

    • Author(s)
      高橋優喜, 古谷寛治、井倉正枝、井倉 毅
    • Organizer
      第42回日本分子生物学会
  • [Presentation] データベース解析から紐解くがん細胞のゲノムDNA損傷ストレス抵抗性獲得戦略2019

    • Author(s)
      古谷寛治、井倉正枝、井倉毅
    • Organizer
      第42回日本分子生物学会

URL: 

Published: 2021-01-27  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi