2020 Fiscal Year Research-status Report
Mechanistic studies of double-strand break repair at repeated sequences in the genome
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19K12328
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| Research Institution | Meisei University |
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Principal Investigator |
香川 亘 明星大学, 理工学部, 教授 (70415123)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 二重鎖切断修復 / DNA修復経路 / 反復配列 / ミスマッチ塩基対 / DNAアニーリング反応 / RAD52 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトのゲノムDNAの約50%は，繰り返し配列である。繰り返し配列が密集するゲノム領域で生じたDNA二重鎖切断損傷は，RAD51タンパク質に依存した修復経路の他に，RAD52タンパク質に依存した修復経路がはたらくことがわかっている。RAD51に依存した修復は一般的に正確性が高いと言われているが，繰り返し配列上では，間違った場所でDNA鎖交換反応を触媒してしまう危険性があり，修復後の染色体に重大な欠失，重複，逆位，転座等の染色体異常が生じる可能性がある。一方，RAD52に依存した修復（single-strand annealing: SSA）は，切断末端同士をアニーリングする反応によって切れた染色体同士をつなぐことから，大規模な染色体異常は発生しないことが考えられる。これらの修復経路の使い分けがどのようになされているのかは不明であり，それを明らかにすることはゲノムの安定維持の機構を理解する上で重要である。
本研究では，SSA修復におけるDNA末端同士のアニーリング反応に着目し，アニーリングの際に頻繁に生じると考えられるミスマッチ塩基対の形成がSSA修復の効率にどのように影響するのかを明らかにすることを目的としている。そのために，RAD52のアニーリング触媒活性をin vitroとin vivoで評価する実験系を用いて明らかにする。本研究では既にRAD52が触媒するDNAアニーリング反応においてミスマッチ塩基対の形成が許容されることを見出している。そこで，アニーリング反応におけるミスマッチ塩基対の許容に重要なRAD52のアミノ酸残基を，点変異体解析やアニーリング中間体の立体構造解析によって明らかにする。これらの解析から，繰り返し配列で生じた二重鎖切断が修復されるときに，どのような分子機構でRAD52に依存したSSA修復が選択されるのかについて重要な知見が得られることが期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
既に確立しているDNAアニーリング反応を検出するin vitroの実験系（蛍光分子で標識したDNA基質を用いたゲルシフト・アッセイ法）を用い，ミスマッチが生じる様々な種類のDNA基質に対するRAD52のアニーリング触媒効率を比較した。その結果，RAD52が触媒するアニーリング反応において許容されるミスマッチの頻度を明らかにすることに成功した。それと並行して，細胞内アニーリング反応系に用いる細胞株の樹立にも成功した。具体的にはRAD52依存的アニーリング反応を検出できるGFPレポーターアッセイ系に，試験管内で見出されたRAD52が許容するミスマッチの種類をレポーターアッセイ系に導入した細胞株を構築した。この細胞株を用い，in vivoでのRAD52のアニーリング触媒効率を調べたところ，in vitroの結果と一致する結果が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に構築した細胞株を用い，ミスマッチの頻度がin vivoにおけるRAD52のアニーリング触媒活性にどのような影響を及ぼすのかを詳細に解析する。さらにRAD52・単鎖DNA複合体の立体構造（Saotome et al., iScience, 2018）をもとにミスマッチの許容に関与するアミノ酸残基を予想し，その点変異体をin vitro（ゲルシフト・アッセイ法など）及びin vivoの系を用いて解析する。
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[Journal Article] Improved methods for preparing the telomere tethering complex Bqt1-Bqt2 for structural studies.2020
Author(s)
Yuzurihara H, Aizawa Y, Saotome M, Ichikawa Y, Yokoyama H, Chikashige Y, Haraguchi T, Hiraoka Y, Kurumizaka H, Kagawa W.
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Journal Title
Protein J.
Volume: 39
Pages: 174,181
DOI
Peer Reviewed
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