2019 Fiscal Year Research-status Report

放射線抵抗性コケ植物は相同組換えだけでDNA2本鎖切断を修復できるのか？

Research Project

Project/Area Number	19K12332
Research Institution	National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology
Principal Investigator	横田裕一郎国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所放射線生物応用研究部, 主幹研究員(定常) (30391288)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	坂本綾子国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所放射線生物応用研究部, 上席研究員(定常) (00354960)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	ヒメツリガネゴケ / 放射線抵抗性 / DNA2本鎖切断 / パルスフィールドゲル電気泳動 / 相同組換え修復 / RAD51B / ゲノム編集 / CRISPR-Cas9
Outline of Annual Research Achievements	DNA 2本鎖切断(DSB)は、相同組換え(HR)で正確に、あるいは、非相同末端結合(NHEJ)やオルタナティブ末端結合(alt-EJ)で不正確に再結合される。我々は、コケ植物のヒメツリガネゴケが有する放射線抵抗性が、HRに係るRAD51B遺伝子をノックアウト(KO)すると失われることを発見した。そこで本研究では、rad51b株に加えて、NHEJに係るLIG4遺伝子をKOしたlig4株、alt-EJに係るPOLQ遺伝子をKOしたpolq株と、それぞれの遺伝子を二重あるいは三重にKOした株を作製し、放射線抵抗性とDSB再結合能力を調べる。KO株の作製はCRISPR-Cas9法で行う。この方法では、低い確率であるが、KOしたい遺伝子と類似の配列を持つ別の遺伝子をも誤って壊してしまう。この問題をクリアするため、それぞれの遺伝子について、異なる配列を標的とした複数系統のKO株を作製する。本年度は、rad51b株、lig4株とpolq株を2系統ずつ作製した。いずれの系統でも、rad51b株は放射線抵抗性を失ったが、lig4株とpolq株は親株と同程度の放射線抵抗性を維持した。次に、放射線照射直後に生じたDSB数と培養後に再結合されずに残存しているDSB数をパルスフィールドゲル電気泳動法で定量し、親株とKO株間でDSBの再結合能力を比較した。その結果、DSBの半数が再結合されるのに必要な時間は、親株の約2時間から、rad51b株、lig4株とpolq株のいずれでも約6時間に延びた。これらの結果は、HR、NHEJとalt-EJはいずれもDSBの再結合に寄与するが、生存に必須の遺伝子に生じたDSBはHRで正確に再結合する、何らかの仕組みがあることを示唆する。この仕組みの解明は、HRによる正確なDSB再結合の効率を高めることで、ゲノム編集技術の高度化や放射線抵抗性の賦与への貢献が期待できる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究では、RAD51B、LIG4あるいはPOLQ遺伝子をKOした株と、それぞれの遺伝子を二重あるいは三重にKOした株を2系統ずつ、合計で14系統作製し、それぞれの株の放射線抵抗性とDSB再結合能力を調べる。本年度までに、rad51b株、lig4株とpolq株を2系統ずつ、合計6系統作製し、放射線抵抗性とDSB再結合能力を調べることができた。以上のことから、本研究は現時点でおおむね順調に推移していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	今後は、RAD51B、LIG4あるいはPOLQ遺伝子を二重あるいは三重にKOした、rad51b-lig4株、rad51b-polq株、lig4-polq株とrad51b-lig4-polq株を2系統ずつ、合計で8系統作製し、それぞれの株の放射線抵抗性とDSB再結合能力を調べる。また、本年度の研究成果として、ヒメツリガネゴケでは、誤った再結合により細胞死に繋がるような、生存に必須の遺伝子に生じたDSBを、HRで正確に再結合するような未知の仕組みがある可能性が示された。そこで、この仕組みを解明するために、ChIP-Seqなどの手法で、RAD51B、LIG4とPOLQ遺伝子産物が結合するDNA配列を網羅的に解析し、HRとNHEJあるいはalt-EJでDSBが再結合される領域に違いがあるのかどうかも調べたい。
Causes of Carryover	KO株の作製やDNA2本鎖切断の定量実験などが順調に進み、予定していた予備実験や反復実験のいくつかを行わずに済んだため、実験補助員の雇い入れ時間や購入する試薬の種類・量が予定より減少した。今年度に得られた成果から、次年度にはChIP-Seq実験を追加で実施したいと考えており、繰り越しさせていただいた助成金は、そのための費用として充てさせていただきたい。