2020 Fiscal Year Research-status Report
核内受容体どうしの協働作用が引き起こすビスフェノールの低用量シグナル毒性効果
| Project/Area Number |
19K12340
|
|---|
| Research Institution | Sojo University |
|---|
Principal Investigator |
劉 暁輝 崇城大学, 生物生命学部, 准教授 (60596849)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | 核内受容体 / ビスフェノール / 協働作用 / シグナル毒性効果 / 転写制御 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
内分泌撹乱物質・ビスフェノールＡ（BPA）は、特に胎児・乳幼児への低用量効果が強く懸念され、多くの国でその使用が禁止された。それに伴い、BPAの代替えに種々の「新世代ビスフェノール」が開発されてきたが、それらの核内受容体に対するシグナル毒性の解析はほとんど進んでおらず、野放しの状態になっている。こうしたなか我々は、BPAのエストロゲン受容体α（ERα）での弱い活性が一群の自発活性化型核内受容体の共発現下では非常に大きく増強されるという、きわめて特異な現象を発見した。本研究課題では、BPAの核内受容体を介した低用量シグナル毒性への協働効果について、その分子機構の解明に取り組むことにした。本年度、明らかとなった主な事項は、以下の通りである。
これまでに、エストロゲン関連受容体γ型（ERRγ）がERαと協働作用する際には、これらの核内受容体ERRγと ERαともにホモダイマーであることが必須なことを明らかとした。本年度は、まずERαに対して協働作用を示すERRαついても、そのホモダイマー構造が必須であることを明らかとした。
一方、一連の新世代ビスフェノールについて、核内受容体を介したシグナル毒性の分子機構解析を進め、前年度までに「ERαにはアゴニスト、ERβにはアンタゴニストとして働く」ビスフェノールが多数存在することを明らかにした。本年度は、これらの「二機能性ビスフェノールのERβアンタゴニスト活性はどのようにして起こるのか？」 の究明に取り組んだ。現在までに、ERβのリガンド結合ドメイン(LBD)のアミノ酸変異の系統的な解析から、その原因となる主要な構造要因を明らかにした。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
三年計画の二年目である本年度は、コロナウィルスの感染拡大のために研究活動が大きく制約された。このため、集約的な研究展開に努め、重要な成果を得ることに成就した。
本年度は、ホモダイマーERαに協働する自発活性化型核内受容体はすべてホモダイマーか？ を探求するために、まずERRαについて検討した。リガンド結合ドメイン（LBD）のX線結晶構造を参照して、ダイマーインタフェースを構成するα-ヘリックスペプチドについて発現プラスミドを作製した。これらのペプチド遺伝子とERRαを共発現させて調べたところ、活性はペプチドの濃度依存的に抑制された。さらに、分子間相互作用に参加しているアミノ酸をAlaに置換して調べた結果、ERRαの活性が失われ、また、ERαに対する協働作用も失われることが判明した。これらにより、ERRαはホモダイマーとして機能することが証明された。
BPAF、BPCを含む複数の二機能性ビスフェノールが 『ERαにアゴニスト活性を示すのに、なぜERβにはアンタゴニスト活性を示すのか？』を調べるため、その構造要因を解析した。まず、ERαとERβのLBDのアミノ酸配列の比較・検討から、両者で異なるアミノ酸を全て同定した。さらに、ERαについて、Ｎ端ドメイン中の活性化要因構造AF-1がLBDのどこに結合するのかを突き止めるため、クライオ電子顕微鏡法で解明された複合体構造を参照しながら検討し、LBD上の２つループ領域の同定に成功した。そして、これらに基づいてERβの構造要因をERαのものへ変異させて調べ、その結果、これらのうちの一つが必須な構造要因であることを突き止めた。現在、これらの構造要因が機能発現に果たしている役割について、X線結晶構造を用いたドッキングモデリング計算で検証している。
以上のように、本研究は概ね順調に進展している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
令和３年度は本研究課題の最終年度として、まず、ERαとERβに対する自発活性型核内受容体の協働作用に必須な構造要因の解析に引き続き取り組む。リガンド結合ドメインのみした変異タンパク質、AF-１を欠損した変異タンパク質などを用いて、協働作用の実働ドメインを見出す解析実験を実施する。さらに、ERαに対する協働作用を示す残り４種の自発活性型核内受容体について、それらもホモダイマーである必要があるか？ を検討する。新世代ビスフェノールの核内受容体に対するシグナル毒性に関しては、結合性が既知のER以外の核内受容体について、その転写活性を調べる。また、二機能性ビスフェノールのうち、ERβに結合する場合にBPAFやBPCとは異なるERβの構造要因を必要とすると推定されるものについて、その構造要因の解析に努める。こうして、今後の研究を鋭意に推進する。
|
| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症の世界的な急拡大の影響により、一部の試薬や消耗品について注文・納品が遅延したり、中途で在庫切れになったり、年度内に納品が間に合わなかったものが多くあった。そのため、次年度での支払いが必要であり、次年度使用額が生じた。なお、未納品のものについては、次年度の５月までには納品される見込みである。現状でもさらにウイルス感染が拡大しつつある。こうした状況を踏まえ、最終年度となる次年度の研究は、必要な試薬と消耗品などは可及的に早急に注文、購入する予定である。
|
