2019 Fiscal Year Research-status Report
Molecular mechanism of acrylamide-induced mutagenesis via translesion synthesis
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19K12348
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
赤木 純一 国立医薬品食品衛生研究所, 病理部, 主任研究官 (60512556)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横井 雅幸 神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 准教授 (00322701)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | グリシドアミド / アクリルアミド / 遺伝毒性 / 突然変異 / 損傷乗り越えDNA合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
食品の加熱調理により生成する発がん性物質であるアクリルアミドは生体内でグリシドアミドに代謝され、ゲノムDNA中のデオキシグアノシン（dG）のN7位に付加体（GA7dG）を形成する。本研究では糖部を2′-デオキシ-2′-フルオロアラビノグアノシンに置換した安定化アナログ（GA7FdG）を用いて、シャトルベクターを用いた細胞内損傷乗り越えDNA合成（TLS）アッセイ、および精製DNAポリメラーゼと基質DNAを用いたin vitro TLSアッセイにより、ヒト細胞におけるアクリルアミド誘発遺伝毒性・突然変異原性に寄与するTLSポリメラーゼを解析している。
細胞内TLSアッセイでは、色素性乾皮症C群患者由来皮膚線維芽細胞（XP4PASV）におけるGA7FdG鎖の複製効率は損傷のないコントロールベクターと比べて半分程度に低下し、GA7FdG特異的に塩基置換変異および1塩基欠失が見られたことから、鋳型鎖上のGA7FdGはDNA複製を強く阻害し、TLSにより点突然変異が誘発されることが示唆された。そこで誤りがちなTLSポリメラーゼであるPolη［イータ］、Polκ［カッパ］をゲノム編集により欠損した細胞を作成し、これらの細胞におけるGA7FdG鎖の複製効率と変異原性の解析を進めている。
In vitro TLSアッセイでは、本研究で用いたTLSポリメラーゼ（Polη、Polι［イオタ］、Polκ、REV1、Polζ［ゼータ］）のいずれも鋳型鎖上のGA7FdGにより著しく阻害され、単独でGA7FdGを乗り越える活性を持つDNAポリメラーゼは見られなかった。これらのTLSポリメラーゼではGA7FdGに対して1塩基だけの取り込みが見られたことから、Polζによる伸長反応が見られるかどうか調べたところ、GA7FdGに対して1塩基を取り込んだ状態からの伸長は全く見られなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
・TLSポリメラーゼ欠損ヒト細胞の作出
本研究ではシャトルベクター上のGA7FdGがヌクレオチド除去修復機構（NER）により除去されないように、NERにおいて損傷認識を担うXPCを欠損したXP4PASV細胞を基にCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集により標的TLSポリメラーゼ欠損細胞を作成している。これまでに、Polκ、Polη、およびPolθの両アレル欠損クローンの作成に成功し、細胞内TLSアッセイを行っている。またPolιおよびREV1欠損クローンについても、現在作成を進めている。
・In vitro TLSアッセイ
3′末端から16番目にGA7FdGを持つ30塩基長の鋳型DNAに15塩基長のプライマーDNAをアニールさせ、GA7FdGの直前からのDNA合成を行わせたところ、主要なTLSポリメラーゼであるPolη、Polι、Polκ、REV1はGA7FdGにより強く阻害されたものの、部分的にGA7FdGに対して1塩基の重合が見られた。そこで、16塩基長プライマーをアニールさせてGA7FdG に対して 1 塩基を取り込んだ状態を再現し、伸長反応を行う”extender”であるPolζによる伸長反応を行ったところ全く伸長反応が見られず、PolζはGA7FdGのTLSに寄与していない可能性が示唆された。そこでextenderとしての活性を持つことが報告されているPolθに着目したが、Polθタンパク質は市販されていないため、まずは細胞内TLSアッセイでの表現型を見ることとし、上述の通りPolθノックアウト細胞を作成した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、まずは現在進めているPolιおよびREV1欠損クローンの作成を行い、これらを用いて細胞内TLSアッセイを行う。現在までに解析が進んでいるPolκおよびPolηノックアウト細胞ではGA7FdGの複製効率の大幅な低下は見られておらず、またin vitro TLSアッセイでも単独でGA7FdGを乗り越える活性を持つTLSポリメラーゼは見つかっていない。一方でこれらのTLSポリメラーゼはGA7FdGに対して1塩基を重合する活性を示すことから、鋳型鎖上の損傷塩基に対してヌクレオチドを重合するinserterとして働く可能性が考えられる。細胞内TLSアッセイでは点突然変異はGA7FdGの部位に特異的であることから、inserterがGA7FdGによる点突然変異に直接寄与すると考えられるので、細胞内TLSアッセイによりGA7FdGによる点突然変異に寄与するTLSポリメラーゼが明らかになったら、dNTP の代わりに dATP、TTP、dCTP、dGTP を単独で加えたシングルヌクレオチドの取り込みアッセイを行い、GA7FdG に対してどの塩基を取り込むかを明らかにする予定である。また、in vitro TLSアッセイではGA7FdG に対して1塩基の取り込みのみが見られ、Polζによる伸長反応も見られなかったにも関わらず、細胞内TLSアッセイでは複製産物が得られていることからPolζ以外の因子が伸長反応に関与している可能性を考えて、ヒト細胞の核抽出液を用いて伸長反応が見られるかどうか検討する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染拡大に伴う出勤抑制によりシークエンス解析を完了できなかったサンプルがあるため。次年度使用額は2020年度に繰り越して解析を行うために使用する。
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Research Products
(3 results)
