2019 Fiscal Year Research-status Report
DNAポリメラーゼζ（ゼータ）の変異生成・抑制における損傷特異性
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19K12349
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
石井 雄二 国立医薬品食品衛生研究所, 病理部, 室長 (70544881)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ポリメラーゼζ / 損傷乗り越え複製 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
環境化学物質に対するポリメラーゼζ（ゼータ）の変異生成・抑制の分子機構を明らかにするため、種々のDNA損傷を引き起こす腎発がん物質をPolzの複製忠実度を低下させたPolζノックイン（KI）gpt deltaマウスとgpt deltaマウスに投与し、レポーター遺伝子変異解析をすることでPolzの複製忠実度の低下が突然変異に及ぼす影響を検討した。
令和元年度は嵩高いDNA付加体を形成する腎発がん物質ルビアジンを用いて検討を行った。ルビアジンをPolz KI gpt deltaマウスとgpt deltaマウスに0、100、200又は400 ppmの濃度で4週間混餌投与し、腎臓におけるレポーター遺伝子変異解析を行った結果、100 ppm群から両遺伝子型でgpt変異体頻度の有意な上昇が認められたものの、遺伝子型間の差は見られなかった。一方、得られた変異体の変異スペクトラム解析を行った結果、Polz KI gpt deltaマウスではgpt deltaマウスに比してG:C-T:A transversion及びG:C-A:T transitionの頻度が減少したのに対し、連続した又は数塩基にまたがった2～3塩基で変異が生じる特徴的なcomplex変異が多数検出され、その頻度はgpt deltaマウスに比べ2倍上昇した。さらに、これらcomplex変異の3'又は5'末端の多くがグアニン塩基であったことから、Polzがルビアジンのグアニン塩基の損傷から生じたミスマッチ末端からの伸張反応を行っていることが示唆された。また、これらの損傷の損傷乗り越え複製（TLS）は行わないと考えられた。PolzはベンゾピレンによるDNA損傷のTLSとミスマッチ末端から伸張反応を行うことから、その働きには基質となるDNA付加体の構造に特異性があることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和元年度は、腎発がん性を有するアカネ色素の構成成分の一つで、アントラキノン骨格を有するルビアジンを用いて検討を行った。Polz KI gpt deltaマウス及びgpt deltaマウスへの28日間の投与を実施し、発がん標的部位である腎臓についてレポーター遺伝子における変異解析を実施した。さらに得られたコロニーについて塩基配列解析を実施、得られた変異スペクトラムからPolzの複製忠実度の低下によって変異スペクトルが変化することを明らかにすることができた。変異の原因となるDNA付加体の測定については現在実施しているが、令和2年度に実施予定出会った臭素酸カリウムを用いた動物実験も平行して進行しており、当初の予定に影響はないと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度は活性酸素種生成によって腎発がんを引き起こす臭素酸カリウムを用いて、酸化的DNA損傷に対するPolzの働きを検討する。Polz KI gpt deltaマウスとgpt deltaマウスに臭素酸カリウムを0、375、750または1500 ppmの濃度で13週間飲水投与し、腎臓を採取する。酸化的DNA損傷の指標である8-OHdGの測定と、gpt assayおよびSpi- assayによるin vivo変異原性の検索を実施し、それぞれの変異頻度について遺伝子型間の違いを検討する。また、令和3年度は腎発がん物質であるカビ毒オクラトキシンAを用いて、DNAの二重鎖切断に対するPolzの働きを検討する。
なお、これらは当初の研究計画とおり推進している。
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| Causes of Carryover |
DNA付加体測定及び変異解析から得られらた一部のコロニーのシークエンス解析が次年度にずれ込んだため、それに必要な試薬及び解析費が次年度使用分として生じた。生じた差額は、次年度、当初の目的であるDNA付加体測定及びシークエンス解析に使用する。
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