2020 Fiscal Year Research-status Report

Development of sample preparation for single cell 3D mass spectrometry imaging

Research Project

Project/Area Number	19K12754
Research Institution	National Institute of Genetics
Principal Investigator	正木紀隆国立遺伝学研究所, 遺伝メカニズム研究系, 特任研究員 (80614073)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	イオン化効率 / 細胞形態
Outline of Annual Research Achievements	本研究計画では従来のTOF-SIMS測定では脱落してしまっていた細胞内生体分子の3次元分布を「生きた」状態に近い形で可視化することを目的としている。そのために同じ真空測定である電子顕微鏡用の固定法のTOF-SIMS用への改良と、MALDI-MSIで開発したイオン化向上前処理のTOF-SIMSへの応用を実現する。最終的にはこれらを組み合わせてこれまでTOF-SIMSで検出できなかった細胞内構造をとらえることを目指す。令和二年度は3T3-L1細胞にたいして細胞内構造を保持するためのグルタアルデヒド固定の条件を検討した。これは当初令和元年度に計画されていたが、令和二年度に予定していた前処理法の開発によるイオン化効率の向上と入れ替えたたため本年度の実施となった。これは二つの理由によるものであり、一つは研究代表者の異動に伴い細胞培養設備と電子顕微鏡設備の利用が困難となったためである。もう一つは細胞培養のための環境を構築する必要が生じたためである。したがって本年度の研究計画遂行にあたってまずCO2インキュベータを導入することで細胞の培養環境を構築し、試料の作成を可能にした。次に浜松医科大学先進機器共用推進部の受託測定制度を利用し、走査電子顕微鏡および透過電子顕微鏡をもちいた測定を行った。これらの測定により、従来の質量分析イメージング法でもちいられていた試料前処理では細胞内構造が脱落していたこと、本法でもちいるグルタルデヒド固定で電子顕微鏡観察用の前処理法と同程度に脂肪滴などの構造が保持されていることを明らかにすることに成功した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 計画していた3つの研究項目のうち細胞の固定条件の検討を達成することができたため、研究計画全体のうちの進捗状況としては順調であると考えている。本研究開発で標的としている脂肪滴の形態について本法でもちいる固定法と通常の電子顕微鏡観察でもちいられる固定法で同等の形態を示すことに成功したためである。もう一つの研究項目であるイオン化効率向上のための前処理法の開発については前年度に脂肪細胞化を誘導する前の3T3-L1前駆細胞をもちいることで達成している。そのため本研究課題の2/3を進めることに成功しているとみなし、全体の進捗状況としてはおおむね順調に進展している。その一方で、細かい点ではあるが、脂肪細胞へ分化した3T3-L1をもちいた脂質の検出については令和二年度に行うことはできなかった。これはCOVID-19のまん延により発令された緊急事態宣言と装置の故障が重なったことにより、名工大でのTOF-SIMSを利用することができなかったためである。同等のスペックを持つ装置を予算内で利用することができる機関が他にないため、令和二年度中のTOF-SIMS測定を断念し、令和三年度に三次元解析とまとめて行うこととした。
Strategy for Future Research Activity	令和三年度はこれまでに確立した細胞の固定法とイオン化効率を向上する前処理法を組み合わせることで、脂肪細胞に分化させた3T3-L1のTOF-SIMS解析を行う。その際にネックになるのは装置の使用料である。ガスクラスターイオン銃をもちいた試料の切削や三次元質量分析イメージングに要する時間は一日を超えることもあるため、装置の利用料は20万円を優に超えてしまう。また、申請時に比べて利用料が高くなったこともあり、可能な測定は2~3回程度と考えている。そのため、前駆細胞に対する測定など異なる条件との比較による実証は難しい。脂肪滴由来のトリアシルグリセロールおよびその断片化した分子の検出と、脂肪滴の電顕像と類似したイオン像の取得を優先的に目指し、その後で補助的なデータを取得していくことにする。ほぼ計画通りに遂行できているものの、COVID-19の感染は未だに終焉せず予断を許さぬ状況であるため、測定のための移動や名古屋工業大学の受け入れもままならなくなる可能性は十分ある。その場合は本研究課題の延長なども視野に入れ、無理に測定を行うということを避けることも必要と考えている。
Causes of Carryover	COVID-19のまん延により愛知県が緊急事態宣言下となったことと、解除後も装置が故障し、令和二年度以内に修理が行えなかったことによりTOF-SIMS測定を実施できなかったことが主な理由である。これにともない、当初予定していた試料のスパッター（切削）にもちいるガスクラスターイオン銃の使用料およびその調整のために先行研究での共同研究者への謝金として計上していた額を次年度に持ち越す必要が生じた。そのため、令和三年度に持ち越した額については、主としてガスクラスターイオン銃をもちいたスパッターと組み合わせた測定の費用、および旅費と謝金として使用することを計画している。また、必要に応じて細胞培養環境の整備など試料作製に必要な物品やデータ解析ソフトに割り当てることも予定している。