2019 Fiscal Year Research-status Report

製造工程で利用可能なヒト多能性幹細胞における新規バイオマーカー技術の構築

Research Project

Project/Area Number	19K12755
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	川瀬栄八郎京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 特定講師 (70402790)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	再生医療 / 幹細胞 / 多能性幹細胞 / ヒトES細胞 / バイオマーカー
Outline of Annual Research Achievements	ヒトES細胞、ヒトiPS細胞などのヒト多能性幹細胞(以下、ヒトES細胞と略する)を用いた臨床研究が現在世界中で進められており、再生医療の発展が大きく期待されている。再生医療において実際に使用されるのは、ヒトES細胞自体ではなく、そこから分化誘導した神経細胞、心筋細胞、膵臓細胞などであるが、これら分化細胞の出発点としてのヒトES細胞の大量培養は不可欠であり、同時にその細胞の品質管理も行うことは重要である。ヒトES細胞の品質評価としてその最終培養産物を用い、遺伝子発現、タンパク質発現、細胞表面抗原の発現、染色体の正常性などで評価を行うことが一般的だが、いずれも細胞の一部を採取して行う破壊検査である。しかしながら、細胞の大量培養では最終生産物での評価だけではなく、製造工程でのリアルタイムモニタリングによる品質評価を行う必要があるが、現在ヒトES細胞が有する特性面を考慮した品質評価に関しては未だ行われていない。本研究課題の目的は、ヒトES 細胞の大量製造工程で品質評価に利用可能な新規のバイオマーカー技術の構築であり、本研究課題によって効率的なヒトES細胞の拡大培養が発展するだけではなく、ヒトES細胞の有する新しい特性を見出し、さらにその細胞生物学的分子機構を解明していくことを目指している。当該年度は、まずヒトES細胞と分化細胞での遺伝子発現・タンパク質発現の比較を行い、候補分子の選定を進めた。その際、我々は培地中に分泌することが期待される分子に特に着目した。分泌分子であれば、細胞を破壊的に操作する必要がなく、培地交換の際に回収した廃棄培地を用いるため、迅速で簡便な評価が期待できるからである。有力候補1分子を含むいくつかの候補分子を決定し、ヒトES細胞の未分化→分化への過程での発現量の変化について自ら実験を行って検討し、その選定の妥当性の検討を進めた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究計画では製造工程でヒトES細胞の特性に関する品質評価として利用可能なバイオマーカーの同定を目指すだけではなく、なぜそのバイオマーカーが有効なのか、その分子制御機構を解明し、ES細胞の特性に対して新たな知見を見出していくことである。そこで我々は未分化細胞と分化細胞での遺伝子発現及びタンパク質発現の比較を行った。両細胞間での比較は、先行論文がいくつもあり、その論文でのデータを有効活用できるからである。その際、従来から良く研究されている転写分子などではなく、細胞外に分泌される分子に着目した。分泌分子ならば、細胞を採取することなく、培地交換の際に生じる廃棄物での評価が可能であり、本研究目的と一致しているからである。検討の結果、1つの有力候補分子を含む、いくつかの候補分子の選定を行った。選定した分子の発現が、未分化状態のヒトES細胞に分化誘導を行い、その発現変移について自ら検討を行った。その結果、有力分子を含むいくつかの分子についてはヒトES細胞の分化に伴い、その遺伝子発現が低下することを見出した。
Strategy for Future Research Activity	本研究課題の今後の推進法策としては以下の様に設定している。 2020年度は候補分子の定量化法の構築と評価…(1)培養したヒトES細胞の一部を抽出し、タンパク質発現などを解析し評価する方法、(2)培養した培地上清を用いELISA、質量分析器などを用いて評価する方法最終ゴールとしては培地上清を回収し、定量的に評価することであるが、候補分子が細胞内にどれだけ蓄積され、その一方で培地中にどの程度分泌されるのかの検討も行うため、両実験を行う。さらに、未分化状態の細胞と分化細胞を混合し、候補分子の発現量が、未分化状態細胞の量とどれだけ相関関係があるのかについても検討を行う。 2021年度　候補分子の細胞生物学的機能に関する研究…候補分子がなぜ未分化・分化状態のマーカーとなるのか、その発現制御機構の検討を行う。また候補分子がヒトES細胞の未分化維持などに効果があるかどうかについても検討を行う