2020 Fiscal Year Research-status Report
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19K12762
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
塚田 孝祐 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 教授 (00351883)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
毛利 聡 川崎医科大学, 医学部, 教授 (00294413)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 超解像 / 酸素分圧 / シングルセル / イメージング / 代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和2年度は超解像光学系による画像取得の高速化および3次元超解像イメージングへの拡張について研究を行った．
提案するSwitching LAser Modes microscopy (SLAM)法による超解像イメージング法は，ガウシアンおよび中空ビームそれぞれで取得した画像の差分を取ることによって超解像を得るため，最終的な超解像画像を得るまで時間を要する．画像取得時間の延長は対象への光毒性を誘発し，また時間分解能が低下するため動的な情報を得ることが困難になる．画像取得の一連の動作としてレーザの二次元スキャン，レーザモードの切り替え，各ピクセルにおける燐光寿命波形の取得，及び酸素分圧の算出があり，どのプロセスを時間短縮することで高速化に繋がるかを精査した．まず，ステージ制御による二次元スキャンを高速ミラーによる走査に変更し，次に色素を発光寿命が長いPd系からPt系に変えることでおよそ2倍の高速化を実現した．さらに発光寿命計算にrapid lifetime determination (RLD)法を用いることで更なる高速化を実現した．
上記と並行し，3次元的超解像イメージングに向けた基礎実験を行った．一般に顕微対物レンズを介した光は平面方向よりも深さ方向に点像分布し，従って深さ方向の空間分解能が低下する．そこで，対象組織を回転させることで全方向で超解像を得ることを考案し，基礎実験を行った．Polydimethylsiloxane内に無作為に1 mMのRhodamine 6G溶液の液滴粒子を散在させ，粒子から発する蛍光強度分布の半値全幅を測定した．その結果，深さ方向に対して平面方向は2.5倍の分解能向上が期待できることが明らかになった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度末において，次年度の課題を顕微光学システムの高速化，生体ファントムを用いた深さ方向分解能の向上とし，それぞれの計画課題において成果を得たため順調に進展していると考えられる．
まず，高速化においては，4000 pixel程度の画像取得を1分以内で取得でき，更なる短寿命の色素を用いることで4倍の高速化を見込めることが明らかになった．しかし，短寿命のプローブ色素の酸素依存性は低いため，シグナルノイズ比を低下させる懸念があり，測定精度とのトレードオフになるため，生細胞など色素濃度の取り込みが低下する対象においては特に測定精度が課題になると思われた．
深さ方向の分解能向上のためにPolydimethylsiloxane内にランダムに分布する蛍光色素を用いた．偶発的に生成される粒子を対象にしたため，十分正確な点像分布を得られなかった可能性が残された．粒径が明らかなポリマー微粒子を用いて追加実験を継続中である．
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度となる令和3年度は当初の予定どおり生細胞の酸素イメージングを行う．生細胞イメージングに先駆け，酸素感受性色素を包埋した樹脂ナノビーズを疑似細胞（ファントム）として作製し，平面および深さ方向において高い空間分解能の実現を実証する．特に，今年度提案した3次元超解像イメージング法をファントム実験から検証し，3次元画像を高精度に再構成するアルゴリズムを考案する．
酸素プローブは生細胞への取り込み量が低いため，酸素イメージングに先駆けて生細胞への取り込み量が期待できる蛍光色素を用いて超解像イメージングを行い，作製した光学系の生細胞イメージングへの適用を検証する．本実験では十分な蛍光輝度を期待できるため，ガウシアンおよび中空ビームそれぞれの強度プロファイルを調整して本手法による最大の空間分解能を決定する．培養細胞は4T1マウス乳癌細胞を用い，酸素プローブにはBis[2-(2'-benzothienyl)pyridinato-N,C3'](acetylacetonato)iridiumを用いる．生理的条件下における培養細胞の特にミトコンドリア近傍の酸素濃度を二次元的に取得し，単一細胞内の酸素勾配を可視化することを目標とする．さらに，低酸素ストレスや呼吸活性を人為的に制御することで濃度勾配の時系列変化を捉えることを試みる．
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| Causes of Carryover |
初年度に計画した成果発表の旅費が国内外渡航制限のため余剰となった．また，キャンパス入構制限による実験時間の短縮により，実験消耗品（特に使用期限が短い冷蔵冷凍試薬類）の購入を抑制したため次年度使用額が生じた．今年度得られた成果は次年度の成果発表旅費および分担者と対面会議のための旅費に用いる．同様に前年度購入を抑制した実験消耗品は今年度に実験を行い，初年度の計画通りに実験を遂行する．
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Research Products
(1 results)
