2020 Fiscal Year Research-status Report
Development of highly sensitive biological barrier evaluation method using cellular pH perturbation phenomenon and field-effect transistor
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19K12776
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| Research Institution | Toyo University |
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Principal Investigator |
合田 達郎 東洋大学, 理工学部, 准教授 (20588347)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ｐH摂動 / タイトジャンクション / 上皮バリア / 生体バリア透過 / 高分子ナノキャリア / バイオトランジスタ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生理学や医用工学分野での重要な研究対象である上皮細胞間バリア機能を超高感度かつ選択的に評価する手法の開発をおこなった。上皮細胞間には密着結合（タイトジャンクション：TJ）とよばれるタンパク質構造体による分子ゲートが存在し、細菌・ウイルスの侵入防止や栄養素の吸収といった上皮組織の主要な役割を担っている。また、TJはがん細胞の組織浸潤メカニズム解明や、薬剤送達系のナノキャリア材料開発、組織工学・再生医工学における培養上皮組織の品質管理などにも関連する。一方で、これらの生体バリアの評価系は十分に開発されているとは言い難く、医工学のさらなる推進のためのボトルネックとなっている。
近年、我々は弱酸や弱塩基の水溶液を培養細胞に瞬間的に暴露させた際に細胞微小環境で生じる可逆的なpH摂動現象を見出した。この現象を用いて、昨年度までに、細胞膜やTJの水素イオンなどの極微イオンに対するバリア性の低下を究極の感度で測定できることを明らかにした。
本年度は、ナノ材料と細胞膜との相互作用の解明に取り組み、膜透過時に極微空孔が形成されるか否かの検出や、膜障害機構の種別の判定をおこなった。具体的には、細胞膜透過性ナノ材料として、リン脂質を模倣した両親媒性双性イオン高分子を用いた。独自のpH摂動法と従来法を併用し、本ナノ材料が細胞膜を透過する際に極微空孔形成ではなく膜融合による透過であることを明らかにした。また、スルホベタイン系の両親媒性双性イオン高分子についても同様の検討をおこない、膜透過現象が起こる条件についてポリマー骨格や双性イオンの分子構造ばかりでなく、分子量などの高分子としての性質が影響することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実施計画で想定したように、初年度はTJ破綻と形成の双方についてのpH摂動アッセイの評価を順調に終えた。そして2年目は、予定通り、極微サイズの空孔形成の検出と膜障害機構の種別の判定をおこない、ナノ材料の細胞膜透過現象の分子機構の解明を達成した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本pH摂動法は、高速、安価、非侵襲、高スループット、リアルタイム、１細胞レベルの空間分解能で細胞膜やTJといった生体バリア性を評価できる。そこで、最終年度に、以下に示す実験をおこなうことにより、本技術の有用性と応用の可能性を検証する。
①上皮バリアとナノキャリアの相互作用評価：細胞膜透過性ナノマテリアルを用いた細胞治療・ドラッグデリバリーシステム・生体イメージングが注目されている。そこで、両親媒性リン脂質模倣高分子を強固なTJを有する上皮細胞に作用させた際の上皮バリア透過性評価とそのメカニズム解明について取り組む。上皮組織バリアを介した透過制御が成功すれば、将来、小腸におけるタンパク質製剤の吸収(例：経口インスリン投与)や脳への薬剤送達(例：アルツハイマー治療薬)の開発につながる。
②上皮組織バリア性評価と応用：組織工学・再生医療分野では、体外で培養した組織の「医薬品」としての機能評価や品質管理に本技術は有効であると考えられる。また、上皮間葉転換（EMT）は組織成長因子(TGF-β)等によって誘導される細胞骨格の変容、細胞間接着や極性の消失、遊走性の獲得であり、がん細胞の主要な組織浸潤・転移機構である。近年、エクソソームなどの細胞外ベシクルによるEMTなど、新たなEMTの誘導機構が見いだされている。EMTは分子生物学的に理解されることが多いが、上皮バリアの消失といった細胞機能に主眼を置いた組織生物学的な理解は不十分である。そこで、pH摂動法の利点を生かして、EMT発生時の分子生物学的変化と細胞機能変化の動的連関を解析する。
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