2020 Fiscal Year Research-status Report

幹細胞から成熟赤血球製造効率の向上に向けた赤芽球脱核現象の制御研究

Research Project

Project/Area Number	19K12785
Research Institution	Ehime University
Principal Investigator	満田憲昭愛媛大学, 医学系研究科, 教授 (10314329)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	赤血球分化 / 脱核 / Cyclin D3 / プロテアソーム
Outline of Annual Research Achievements	現在、輸血用の赤血球は献血により100%賄われているが、安定的な供給のためには造血幹細胞やiPS細胞からの成熟赤血球の人工的作製技術の確立が必要である。そのなかで特に問題となっているのは、脱核の効率の悪さである。哺乳類の赤血球分化においてのみ観察される脱核は、赤血球分化の最終過程で行われるダイナミックな生命現象であるが、その分子機構については未だに不明な点が多い。申請者は、脱核時にCyclin D3が分解され、それにより細胞周期制御因子Cyclin D3-Cdk4/6複合体のキナーゼ活性が低下することが赤芽球に脱核を誘導するトリガーとなる可能性があることを見出している。2020年度は脱核時におけるCyclin D3の関与についてより詳細に検討した結果、Cyclin D3の分解を人為的に遅らせることにより脱核の進行が遅れること、またその脱核の遅れがCdk4/6阻害剤の添加によりキャンセルされることを見出した。このことから脱核の開始時期の決定にCyclin D3-Cdk4/6複合体のキナーゼ活性が低下することが重要であることがより強く示唆された。本年度は、脱核開始時期の決定にCyclin D3タンパク質のプロテアソームによる分解が重要な働きをしている可能性を更に検証する為に、プロテアソームによる分解を受けないCyclin D変異体の発現を、レンチウイルスベクターを用いて試みたが、赤芽球内での変異体タンパク質の発現を確認できなかった。また、Cyclin D3タンパク質のプロテアソームによる分解に係るユビキチンリガーゼの候補であるSCF E3 ユビキチンリガーゼ複合体（SCF複合体）の基質特異性を決める構成因子であるF-boxタンパク質のうちFBX20タンパク質の発現がエリスロポエチン刺激共に増加していることを見出した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason これまでの研究により申請者は、細胞周期制御因子であるCdk4やCdk6（Cdk4/6）と複合体を形成しキナーゼ活性を発揮させることが知られているCyclin D3の赤血球分化における挙動について以下のことを明らかにしている。（１）マウス赤芽球をエリスロポエチン（EPO）刺激により分化誘導した際にCyclin D3タンパク質量が増加し、脱核開始時に分解を受ける。（２）脱核開始時にCyclin D3タンパク質はプロテアソームにより分解を受ける。（３）プロテアソーム阻害剤の添加により、Cyclin D3タンパク質の分解が阻害されるとともに脱核の進行が遅れる。（４）EPO刺激による分化誘導の13時間後に２回目のEPO刺激を行うことによりCyclin D3タンパク質の分解が遅れ、かつ脱核の進行も遅れる。この脱核の遅れは、Cdk4/6阻害剤（PD0332991）の添加により緩和される。本年度は、Cyclin D3タンパク質のプロテアソームによる分解に係るユビキチンリガーゼの候補であるSCF E3 ユビキチンリガーゼ複合体（SCF複合体）の基質特異性を決める構成因子であるF-boxタンパク質として、９種類がマウス赤芽球に発現していることを見出した。また、このうちFBX20タンパク質の発現がエリスロポエチン刺激共に増加していることを見出した。この結果から、FBX20タンパク質を含むSCF複合体が脱核時におけるCyclin D3タンパク質の分解に関与する可能性が示唆された。
Strategy for Future Research Activity	脱核開始時期の決定にCyclin D3タンパク質のプロテアソームによる分解が重要な働きをしている可能性を更に検証する為に、プロテアソームによる分解を受けないCyclin D変異体をレンチウイルスベクター以外の方法で赤芽球に導入した場合の脱核率の変化について解析する。また、脱核開始時期の決定のメカニズムをより詳細に理解する為にCyclin D3タンパク質のプロテアソームによる分解に係るユビキチンリガーゼをRNAi実験により同定する。また、ヒト臍帯血由来CD34陽性前駆細胞やマウス由来iPS細胞より誘導した赤芽球に、Cdk4阻害剤を添加することにより、脱核効率が改善することを明らかにする。