Novel strategy of anti-tumor immune therapy using pseudo-infection exosomes presenting artificial neoepitopes

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K12806
• Research Institution: Osaka Prefecture University
• Principal Investigator: 小山 義之 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 客員研究員 (00162090)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: エクソソーム / 人工ネオアンティジェン / 結核菌抗原 / 抗腫瘍免疫 / 樹状細胞

Outline of Annual Research Achievements

腫瘍抗原は一般に免疫原性が低いが、腫瘍特異的な変異型の抗原、ネオアンティジェンは一部高い抗原性を持ち、免疫治療の良いターゲットとなる。しかし、腫瘍細胞がこのようなネオアンティジェンを持つ患者の割合は低い。我々はこれまで、抗原性の高い結核菌抗原、ESAT-6の遺伝子を腫瘍細胞に導入し、「人工ネオアンティジェン」として発現させる新しい抗腫瘍免疫治療戦略を開拓し、その効果を報告してきた。遺伝子導入された腫瘍細胞は、ESAT-6抗原エピトープを「人工ネオエピトープ」として提示したエクソソーム（以下"ESAT-Ex")を分泌し、これを捕食した樹状細胞が「危険信号」と認識して成熟し、抗腫瘍細胞性免疫を誘導すると考えた。
この機序を証明するために予備的な実験として、マウス骨髄にGM-CSFを加えて分化誘導した培養樹状細胞に"ESAT-Ex"を取り込ませ、CD80、CD86、IL-12などの発現が向上することを確認した。
一方この実験では、骨髄細胞から誘導した樹状細胞にはマクロファージが混入しており、活性化に関与している可能性が考えられた。そこで今年度は、マウス骨髄細胞を分化誘導後に、マグネット標識した抗体を加えて自動磁気細胞分離装置(オートマックス)を用いて樹状細胞のみを単離し、マクロファージ非存在下での"ESAT-Ex"の効果を調べた。
オートマックスで単離した樹状細胞は、"ESAT-Ex"の添加一日後、三日後ともにCD86の発現が向上した。一日後の発現について再現性を調べたところ、P = 0.01で有意な発現の上昇が確認された。
さらに、マクロファージの共存効果を調べるために、少量のマクロファージを樹状細胞に加えて共培養した系でも同様の実験を行い比較したところ、CD86の発現量に有意な差はなく、"ESAT-Ex"は直接樹状細胞を刺激して活性化していることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

「人工ネオエピトープ提示エクソソーム」（"ESAT-Ex")によって抗腫瘍免疫が活性化されることは、担癌モデルマウスを用いたin vivoの実験で確認してきた。そのメカニズムとして、"ESAT-Ex"が樹状細胞を刺激して成熟させ、抗腫瘍細胞性免疫を誘導すると考えた。しかし、その活性化が直接の樹状細胞への働きかけによるものなのか、あるいはマクロファージなどが介在してのものなのか不明であった。
今年度は自動磁気細胞分離装置で単離した樹状細胞に"ESAT-Ex"を加えて評価することで、"ESAT-Ex"が直接樹状細胞に刺激を与えて成熟させている機序が始めて確認された。
また、同手法を応用して抗腫瘍免疫誘導のメカニズムをさらに詳細に検討する手法が開かれた。

Strategy for Future Research Activity

マウス骨髄細胞を分化誘導後に、自動磁気細胞分離装置(オートマックス)を用いて単離した樹状細胞に「人工ネオエピトープ提示エクソソーム」"ESAT-Ex"を加えて、樹状細胞の形態変化、IL-12発現などを詳しく調べ、"ESAT-Ex"の活性化の機序を詳細に検討する。
また以前の実験では、in vivoでのESAT-6遺伝子の投与が自然免疫を効率よく活性化することも確認している。そこで今後は培養マクロファージを用いて"ESAT-Ex"への応答をしらべ、各種サイトカインの分泌などを分析して"ESAT-Ex"の自然免疫活性化の効果についても検討を行っていく。
これらと平行して、エクソソームの分泌量、表面へのESAT-6エピトープの提示量などを細かく分析し、"ESAT-Ex"を調製するための最適条件を調べる。また、エクソソームの単離方法、保存方法についても検討を加える。

Causes of Carryover

エクソソームの表面解析の最適化に時間を要したため、単離試薬、標識試薬の消耗が予定よりも少なかった。
解析方法はほぼ目処が付いたため、来年度は今年度予定していた実験を含めて加速して研究を行う。