2020 Fiscal Year Research-status Report
Molecular level evaluation of cell culture substrate and construction of nano-controlled surface toward cell culture standardization
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19K12814
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| Research Institution | National Institute for Materials Science |
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Principal Investigator |
関 禎子 国立研究開発法人物質・材料研究機構, 先端材料解析研究拠点, NIMS特別研究員 (90773309)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
赤池 敏宏 公益財団法人国際科学振興財団, その他部局等, 主席研究員 (30101207) [Withdrawn]
後藤 光昭 公益財団法人国際科学振興財団, その他部局等, 主任研究員 (80235001) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | カドヘリン / AFM / 細胞培養 / キメラ抗体 / QCM |
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| Outline of Annual Research Achievements |
再生医療の実現には、細胞ソース、培養方法、分化誘導方法、大量培養方法など未だ解決すべき問題がある。特に、細胞培養は再生医療の研究開発で最も重要な技術であり、中でも細胞培養用マトリックスは細胞の増殖や分化誘導に決定的な影響を及ぼすことが知られている。従って、標準化された細胞培養基質（ディッシュ表面）が不可欠で有り、系統的に評価する必要があると認識する。今回、ディッシュ表面に、我々が設計・開発してきたキメラ型抗体E-カドヘリン-Fc(E-cad-Fc)タンパク質をコーティングし、その表面の吸着状態・機能発現等について解明し、基板コート標準化材としての可能性を評価する。
本研究では細胞培養基材である培養ディッシュのナノメートルレベルでの構造と機械的特性（弾性率）、分子レベルでの化学的特性（官能基）を系統的に評価しようとするものである。その上で、さらにディッシュにタンパク質やポリマーをコーティングした場合の吸着状態を精査するとともに、コーティング表面の機能および細胞への影響を解明するのが目的である。
昨年度に引き続き、ディッシュ表面にコートしたE-cad-Fc分子の構造と機能を調べるために、より平坦な基板を用いAFM観察をし解析を行った。その結果、Caイオン存在下でのカドヘリン同士の結合の観察に成功し、10年程前より言われているようにシス結合（平行した隣の分子との結合）することなくトランス結合（向かい合った分子との結合）をしていることを確認した。このことは、ディッシュ表面へのコートをコントロールするのに非常に重要である。更に、これにキレート剤を作用させるとカドヘリン同士の結合が切れ、構造が変化していく様子を捉えることに成功した。つまり、この結合・解離は、コーティングしたE-cad-Fcと細胞との相互作用と同等であると考えられ、培養基質上で起こる細胞接着機構の解明に繋がると思われる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、E-cad-Fcをコーティングした培養ディッシュ表面状態の詳細を明らかにするために、①E-cad-Fcの液中での分子構造と機能に関しAFMを用いて解析した。更に別のコーティング物質として、②細胞選択性の高い高分子化合物の水中での基板への吸着状態を確認した。
①昨年度はモデル基板上での吸着状態の解析とE-cad-Fc分子のAFM観察を行ったが、この後半のE-cad-Fc分子について更に構造と機能の解析を行った。E-cadherinは５つの細胞外ドメインを持ち、N末端側のドメインが、向かい合う細胞のE-cadherinの細胞外ドメインとCaイオン存在下でホモフィリックな結合をすると言われている。細胞外ドメインのサイズは長軸約18nm、短軸約2nmである。この結合の状態をAFMで直接観察することに成功した。細胞外部位のサイズ、湾曲したその曲率、ドメイン同志の結合角度は、X線結晶解析のデータと一致した。更にキレート剤を作用させると、ドメイン同志の結合が切れ、細胞外部位の構造が変化していく様子も捉えた。これらはE-cad-Fcコーティングした基板で起こる細胞との相互作用と同等と考えられ、それらを分子レベルで確認したと考えられる。
②高分子化合物PVLA (poly N-p-vinylbenzyl-O-β-D-galactopyranosyl-[1→4]-D-gluconamide)は肝実質細胞が選択的に接着することが今までの研究より分かっている。この糖鎖高分子はすべてのモノマーユニットに親水性の糖鎖側鎖が入ったポリスチレン型高分子で、両親媒性高分子であり水中で高分子ミセル状になる。この高分子の液中でのAFM観察に成功した。サイズは直径数nmであり、X線結晶構造解析結果とほぼ一致した。
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| Strategy for Future Research Activity |
実際に培養に用いられるディッシュ表面を評価し、E-cad-Fcをコーティングした場合と比較する。更にコーティング状態を変えたディッシュ上で細胞培養し、接着性など細胞特性を評価する。これにより、効率のよい最適なコーティング方法を見つけ、基板コート標準化材としての可能性を評価する。
1)E-cad-Fcをコートしたディッシュで細胞培養を行い、タンパク質濃度、Caイオンの有無等最適条件を見つける。2)各メーカの培養ディッシュ表面の形状や分子レベルでの化学的特性を評価する。液中での最表面、つまり細胞が接着する固液界面の水和状態についてFM-AFMを用い評価方法を模索する。3)ラテックス粒子吸着評価法を検討する。ラテックス粒子に安定的にE-cad-Fcをコートする条件をDLS（動的光散乱法）等により確立する。また、ラテックス粒子の化学的性質やサイズも検討する。そのラテックス粒子のE-cad-Fcコートした基板への吸着状態を評価する。
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| Causes of Carryover |
学会開催がすべてオンラインとなり旅費予算に余剰が生じた。今年度は、その分を論文投稿費用、装置使用料、消耗品に使用する予定である。
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