温度制御式反復温熱刺激による骨芽細胞分化誘導法の検討

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K12839
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 冨並 香菜子 東北大学, 歯学研究科, 大学院非常勤講師 (10815351)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 洪 光 東北大学, 歯学研究科, 教授 (70363083) ; 工藤 忠明 東北大学, 歯学研究科, 助教 (50431606) ; 林 陽平 東北大学, 加齢医学研究所, 助教 (00588056) ; 泉 哲 東北大学, 歯学研究科, 大学院非常勤講師 (20835368)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 温熱刺激 / 前骨芽細胞 / 骨再生

Outline of Annual Research Achievements

代表者らはこれまで、培地温度を制御する独自のシステムを用い、神経分化モデル細胞に対し温度制御式反復温熱刺激(略称：TRTS)を負荷し、この刺激のみで神経細胞分化を誘導する方法を開発した。しかし、前骨芽細胞の骨芽細胞分化におけるTRTS の作用は全く不明である。そこで本研究計画では、上述の培地温度制御系を用い、前骨芽細胞株の骨芽細胞分化に与える影響やその機序の解析を実施し、これによりTRTS を活用した細胞環境温度制御による低侵襲かつ安全な骨芽細胞分化誘導法を開発し、またその分子機構を解明することを目指している。
代表者らは、前年度研究にてまずTRTSの適切な負荷条件を明らかにするための実験を行った。その結果として、通常培養下の前骨芽細胞様細胞株MC3T3-E1 細胞にTRTS を負荷した時、加熱プレート温度45°CのTRTS負荷では第1日目にして、42°C以上のTRTS負荷では第2日目以降、細胞死が誘発され、増殖が抑制された。これに対し、39.5°CのTRTSを負荷した場合、37°Cの培地で通常培養した陰性対照群と比較して、細胞増殖が抑制されることはなかった。
これらの結果をもとに、代表者らは今年度研究において、前骨芽細胞のTRTS のみでの骨芽細胞分化誘導が可能かを検討した。具体的には、アルカリホスファターゼ(ALP) アッセイやアリザリンレッド染色を行い、ALP活性や細胞外における石灰化を評価した。その結果、39.5°CのTRTSを負荷した場合、1日6時間または1日18時間の刺激で、骨芽細胞分化誘導を有意に促進し得ることを確認した。今後は、今回得られた結果をもとに、前骨芽細胞の骨芽細胞分化における異なる刺激時間のTRTS の影響をより詳細に評価するとともに、TRTSによる前骨芽細胞様細胞株の骨芽細胞分化促進誘導現象における分子的なメカニズムについても検討を実施する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

令和3年度の研究計画を行った結果、TRTS負荷時の骨芽細胞分化の評価については、概ね順調に進行し、満足する結果が得られた。しかしながら、今年度は新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の影響により、特に前半期には計画の変更を余儀なくされたため、全体としての研究実施計画の進捗は申請時の予定よりやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

今後は今回までの研究結果をもとに、TRTS のみで骨芽細胞分化誘導条件について、刺激時間や温度等、より詳細な負荷条件を精査するとともに、骨芽細胞への分化誘導に通常使用される液性因子として骨形成因子(BMP)を培地に添加し、TRTS を同時に負荷した場合に骨芽細胞分化率がより促進されるTRTS負荷条件を明らかにすることを検討する。
上記計画と並行して、本年度研究にて確認した、TRTSによる前骨芽細胞様細胞株の骨芽細胞分化促進誘導現象について、その分子的なメカニズムの解析も検討する。MC3T3-E1細胞に発現するとされる温度感受性Transient receptor potential (TRP)チャネル分子群や、Heat shock protein (HSP)が骨芽細胞分化・増殖の制御に関与する可能性を、PCR 法、RNA 干渉法およびウェスタンブロット法を用い検討する。

Causes of Carryover

今年度は新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の影響により、特に前半期には計画の変更を余儀なくされたため、今年度未完了の実験計画の次年度における実施のために使用する。