2020 Fiscal Year Research-status Report
光活性化PEG脂質を用いた血球解析・単離技術の医療応用
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19K15366
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| Research Institution | St. Luke's International University |
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Principal Investigator |
山平 真也 聖路加国際大学, 医科学研究センター, 卓越研究員 (70750652)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | シングルセル / PEG脂質 / 刺激応答性材料 / 1細胞分離 / 1細胞解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
現在、次世代の基礎研究や創薬、そして医療の発展のために、1細胞単位で細胞を詳細に解析・単離する技術の開発が必要とされている。しかし、現状では迅速・簡便かつ安価な1細胞解析・回収手法が無く、1細胞技術を使用できる研究者・医療従事者は限られている。そこで、申請者らは、1細胞単位で生細胞を容易に操作可能な光応答性の接着剤(光活性化Polyethyleneglycol(PEG)脂質)を開発した。本研究では、光活性化PEG脂質を用いた1細胞アレイ技術と1細胞回収技術を社会実装が可能な機器レベルまで発展させ、1細胞操作技術が必要とされている2種類の医療へ応用することを目的とした。具体的には、「1細胞アレイを用いたサイトメガロウィルスの検出」と、「がん特異的なT細胞の1細胞単離及び解析」ついて研究を行った。令和2年度の「1細胞アレイを用いたサイトメガロウィルスの検出」に関する研究では、感染細胞となるヒト好中球の1細胞アレイ作製における各種最適化を行い、ロバスト性の高い解析基盤の構築を試みた。「がん特異的なT細胞の1細胞単離及び解析」に関する研究においては、令和元年度に開発した細胞観察が可能な1細胞PCR用容器の改良・発展を行い、汎用のライフサイエンス機器への適用とPCR実験への最適化を行った。令和2年度の研究では、実際に患者由来の検体を用いた実験も行う予定であったが、コロナの影響で患者の研究へのリクルートが困難であったため、令和3年度に実施予定とした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「1細胞アレイを用いたサイトメガロウィルスの検出」
サイトメガロウイルス感染症の検査は、検査技師による血液塗抹標本の目視検査によって行われている。この検査では、数万の好中球と、その内の感染細胞数をカウントする必要があるため、多くの時間と労力がかかる。本研究では、光活性化PEG脂質を用いて好中球の1細胞アレイを作製し、画像解析により迅速に感染細胞を検出する手法の開発を行う。令和2年度は免疫応答である好中球細胞外トラップ(NETs）によって好中球が死滅し、また核酸がPEG脂質表面にまき散らされて好中球の1細胞アレイ化効率が大きく低下する問題の解決を試みた。様々な検討を行ったが、NETsを完全に止めることは難しく、好中球の1細胞アレイ化効率を高く安定させることが困難であった。
「がん特異的なT細胞の1細胞単離及び解析」
細胞集団から1細胞を単離する技術として、全自動1細胞回収機器等が以前より用いられいる。しかし、これらは高度な技術や多大なコストが必要とされるため、限られた研究者にしか使用できず、創薬, 医療, 基礎研究の発展において障害となっている。本研究では、PEG脂質をコートした安価な検査チップのみで多数の細胞集団から1細胞を基板に光捕捉して単離する技術を開発し、がん治療に有用ながん特異的T細胞の1細胞単離と1細胞PCRを行うことを目的とした。令和元年度までに、任意の1細胞のPEG脂質表面上への捕捉と顕微鏡観察とPCRが可能な容器の開発を達成している。令和2年度は、上記容器の形状のPCRへの最適化を行った。まず、汎用的な解析機器に対応するように、384ウェルプレートのフォーマットとした。また、PCRに適した高い熱伝導性を得るために、ウェルの底面が薄くなる様に加工を行ったところ、13.3 ± 2.3 um (n = 384ウェル)という極めて薄い底面を破損なく加工することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
「1細胞アレイを用いたサイトメガロウィルスの検出」
令和2年度の研究では、サイトメガロウィルスの感染細胞となる好中球の1細胞アレイ化において、好中球の免疫応答(NETs)による死滅を完全に止めることが困難なことが判った。そこで、令和3年度の研究では、好中球をホルムアルデヒド等で固定してPEG脂質表面上にアレイ化することを試み、また、NETsを起こしても、DNAse等により核酸を分解することで、好中球の1細胞アレイ化効率を高める。これらの方法で好中球の1細胞アレイ化効率を高めてサイトメガロウィルス検査に十分な数の好中球を1細胞アレイ化し、pp65抗原を指標にサイトメガロウィルス感染細胞の検出を行う。
「がん特異的なT細胞の1細胞単離及び解析」
令和2年度の研究では、細胞観察が可能であり、かつ、PCRに適した容器の開発を達成した。令和3年度は、ヒトがん組織浸潤T細胞からT細胞疲弊分子PD-1と4.1BBに対する蛍光標識抗体を用いてがん特異的T細胞を検出し、光活性化PEG脂質表面を用いてがん特異的T細胞の単離を行う。さらに、このT細胞から1細胞RT-PCRによりTCRのα鎖・β鎖の遺伝子を増幅し、その配列の決定を行う。
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| Causes of Carryover |
令和2年度には実際にヒト検体を用いた実験を数十例行う予定であったが、コロナの蔓延によりヒト検体を用いた実験が限られ、それに伴う抗体試薬やPCR試薬、シーケンス費用といった消耗品費が大幅に減少した。令和3年度には安定してweb上で開催されるようになった学会における発表や、遅れているヒト検体を用いた実験を多く計画している。それに伴う消耗品費や学会参加費用、その他費用等の増分に次年度使用額を充当する予定である。
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