基質特異性の理解に基づく酵素変異体の合理的な設計手法の確立

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K15371
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 森 裕太郎 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 特別研究員 (50758539)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 酵素の合理的設計 / 基質特異性 / ピルビン酸脱炭酸酵素

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、持続可能な環境調和型社会の実現に向けて、目的化合物の生産量を向上させることを目的として、高活性な酵素変異体を合理的に開発するための 設計戦略の確立を目指す。具体的には、ピルビン酸脱炭酸酵素 (PDC) を鋳型酵素として選択した。PDCは様々な置換基を持つ基質からの脱炭酸が報告されていることから、様々なPDCを用いた基質スクリーニングから得られた酵素反応特性(脱炭酸反応が進行するかどうか、また反応速度)と酵素-基質結合モデルとの比 較を行うことで、基質特異性に関わる要素の抽出とそれに基づいた高活性な変異体設計のためのルール構築を行う。
タンパク質の合理的設計(変異体の構築)により、目的のタンパク質機能を向上させる研究においては、変異箇所の絞り込みを行うためにタンパク質の3D情報 が必須である。特に結晶構造が解析されていないタンパク質について、構築した3D結晶構造モデルを元にした変異体設計戦略を確立することは、学術的に重要である。前年度の成果において、結晶構造が明らかとなっていない酵母由来PDCについて変異を導入し、活性残基と思われる箇所にアミノ酸変異を導入した場合に活性が欠損したことから、構築した結晶構造モデルが妥当であると判断した。そこで本年度は、その結晶構造を基に、変異体の構築とPDC変異体の活性測定を行った。その結果、特にフェニルピルビン酸を基質とした場合に、野生型のPDCと比較して約2.8倍活性の高いPDC変異体の獲得に成功した。
また実際に、再生可能資源であるグルコースからの物質生産の検討として、上記PDC変異体を用いることで、香料にも使用される有用化合物フェニルエタノールの生産を試みた。その結果、野生型のPDCを用いた場合と比較して、1.2倍程度
高い生産量を達成した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究課題は本来であれば2020年度までの予定であったが、世界的に蔓延するコロナ禍から、2020年4月から6月まで自宅待機のために研究の中止を余儀なくされ、また研究再開後もコロナ禍に対応した新たな研究環境を整備するために時間を要したため。

Strategy for Future Research Activity

現在、フェニルピルビン酸を基質とした場合に、野生型酵素と比べて高い活性をもつ変異体の取得に成功している。そのため本年度は、作成した変異体を、フェニルピルビン酸以外の基質に当てることによって、活性がどのように変化したかの実データの収集を行う。またそれと並行してコンピューターシミュレーションによって、酵素変異体と基質間の様々な変数がどのように変化したかを計算し、これらを合わせることによって、in silicoでの高活性変異体の設計戦略の確立を行う。
またこれに加えて、実際の物質生産を行うために、高活性を示した変異体については、前駆体化合物生産大腸菌に順次導入し、グルコースからの目的化合物の生産についても検討する。

Causes of Carryover

本研究課題は本来2020年度末までの研究計画であったが、世界的に蔓延するコロナ禍が原因で、研究計画に遅れが発生したため