混合糖の取込能力の向上を指向した適応進化による高発酵性大腸菌株の創出

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K15372
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 和田 圭介 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 材料・化学領域, 研究員 (70828300)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 大腸菌 / 実験室進化 / 代謝工学 / グルコース / キシロース

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、変異導入を応用した実験室進化技術によって、グルコースおよびキシロースを同時に利用できる大腸菌株を創出する。微生物を利用した木質バイオマスからの有用物質生産において、基質である糖の取込速度は目的物質の生産速度を決める要因の１つである。木質バイオマス由来の糖化液に含まれる糖源のほとんどはグルコースとキシロースだが、グルコース存在下では他の糖の取込機能が制限されることが知られており、グルコースおよびキシロースを同時に利用できる大腸菌株の開発が課題となっている。また、糖の取込に関するメカニズムは複雑に制御されているため、糖全体の取込速度の強化に有効な遺伝子改変箇所を人為的に同定および改変することは困難である。そこで本研究では、自然突然変異の導入および蓄積を促進させる条件下で大腸菌株を培養することで、糖全体の取込速度が強化された株の創出を目指す。
本年度は、糖全体の取込速度の強化に向けた自然突然変異の導入および蓄積が促進される選択圧をかけられるシステムの構築に着手した。まず、グルコースあるいはキシロースを単一炭素源とした際に特異的に発現するプロモーターを探索するため、富栄養培地、およびグルコースまたはキシロース最少培地で大腸菌野生株を培養し、対数増殖期中の遺伝子発現量をRNA-seqで分析した。富栄養培地での遺伝子発現量を基準とし、各糖存在下における発現量および発現量比を評価し、各糖存在下で特異的な発現を示す遺伝子を抽出した。また、党全体の取込能力の強化株の物質生産能力を評価するためのモデル系として、D乳酸生産システムを構築した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

申請書の計画では、有用物質の生産能力の評価系としてイソブタノール生産システムを使用する予定だったが、本研究で創出する実験室進化株の培養条件下での使用が困難であることが判明した。そこでまず、先にD乳酸をモデルとする生産システムの構築に着手した。このシステムに関しては十分にデータが確保できており、当初の予定にはなかった部分でも論文化が見込める。しかし、予定の実験室進化システムの構築の進捗は遅滞しているため、やや遅れているとした。

Strategy for Future Research Activity

今後は実験室進化のシステムの構築および培養を進めていく。具体的には、各糖存在下で特異的に発現する遺伝子の発現を制御するプロモーター領域を推定し、糖全体の取込能力の強化に向けた自然突然変異の導入および蓄積が促進される選択圧をかけられることを確認する。次に、実験室進化システムを導入した大腸菌株の継代培養を開始する。継代培養の最中に変異の導入頻度を確認し、必要に応じて進化対象株を大腸菌野生型株から高変異性大腸菌株に変更する。

Causes of Carryover

新型コロナウィルスの影響で、旅費として計上していた費用の使途が無くなったため、次年度に繰り越しとなった。
次年度は使用予定額の大きいゲノムの変異解析を行う予定であるため、その費用として充填する。