メロテルペノイド生合成酵素の精密機能解析を基盤とした構造多様化機構の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K15703
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 森 貴裕 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 助教 (60734564)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 生合成 / X線結晶構造解析 / 酵素工学 / 異性化酵素

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、最近申請者の研究室において見出された、糸状菌由来novofumigatoninの生合成に関わる新規異性化酵素NvfEの詳細なメカニズム解明と機能改変を行うため、NvfEの精製酵素を用いて生化学的性質についての解析を行った。生合成研究において得られた本来の基質のアナログ化合物を用いた酵素反応を行なったところ、D環構造の違う化合物も受け入れ、骨格変換反応を触媒するものの、エンドペルオキシドがない化合物は受け入れられず、a-KG存在下、非存在下どちらにおいても生成物が得られなかった。
また、種々金属イオン存在下での酵素反応を行い、Feのみで反応が進行することを確認した。以上の結果から、NvfEはa-KGを受け入れ、フェリルオキソ中間体を形成できないことが示唆され、Fe原子は活性部位において電子供与の役割を担っていることが示唆される。
また、NvfEの詳細な反応メカニズムを解明するために、本酵素のX線結晶構造解析にも着手し、NvfEのアポ型立体構造の取得に成功した。全体構造は他のメロテルペノイドα-KG依存性ジオキシゲナーゼと類似しているものの、ジオキシゲナーゼ酵素においてopen-closedコンフォメーションに重要なループ部分が、他のホモログ酵素のアポ体構造では常に固定されず電子密度が見られないのに対し、NvfEではアポ体構造でもclosedコンフォメーションを取り、固定されていることが判明した。現在さらなる反応メカニズムの解明のため、基質との複合体構造の取得とループ部分の変異体の作成を試みている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1年目に結晶化まで進行し、二年目以降、ホモログ酵素の解析、結晶構造に基づく変異体導入、及び、更なる機能変換酵素の創出を行う予定であり、本年度は、当初の予定通り、結晶化、構造解析に成功した。現在、複合体構造の取得を試みており、変異体の作成も行なっている。また、in vitroの機能解析もNvfEについても、おおむね順調にしており、基質特異性についていくつかの化合物を検討をした。

Strategy for Future Research Activity

酵素のアポ体構造が得られたので、基質、基質アナログとの複合体構造の取得を継続する。同時に、得られた結晶構造を元に変異体を作成し、活性に重要な残基の特定を行う。さらに、得た立体構造情報、メカニズムの知見を基盤として合理的に酵素の基質の配向、反応制御に関わるアミノ酸配列に変異を導入し、野生型とは基質特異性、反応性を大きく変化させた新規酵素を作成することで、非天然型の新規化合物の創出を試みる。特に、α-KG要求性を回復させる改変を試み、エンドペルオキシドやその他基質類縁体に対して異性化反応のみならず、酸化反応を触媒できる機能改変酵素を作成する。
また、NvfEのホモログ酵素としてNovofumigatonin生合成中にα-KG要求性ジオキシゲナーゼ酵素が存在しているため、それらの機能解析や、他の微生物中に見出されたNvfEと相同性を示す酵素の機能解析に着手する。

Causes of Carryover

翌年度分は申請通り物品費、旅費等に利用する。