2019 Fiscal Year Research-status Report
セラミド-1-リン酸の動的挙動解析に基づくホスホリパーゼA2分子認識機構の解明
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19K15707
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
安田 智一 大阪大学, 理学研究科, 特任助教(常勤) (90771121)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | セラミド-1-リン酸 / 細胞質型ホスホリパーゼA2 / 類縁体合成 / 動的挙動解析 / 分子認識機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞膜上に局所的に分布するセラミド-1-リン酸(C1P)が、どのようにして細胞質型ホスホリパーゼA2(cPLA2α)と特異的に結合するのか、その分子基盤の解明を目指す。そのために、構造改変したC1P類縁体を化学合成し、多様な計測手法を用いて、人工膜や細胞膜におけるC1PおよびcPLA2αとの複合体の動的挙動や相互作用を原子レベルで観測する。
すでに申請者が確立している合成方法に従って、C1P類縁体14種類を得ている。まずはcPLA2αとの結合への寄与が推定されるC1Pドメインの膜物性を詳細に調べることにした。各類縁体の混合する割合を5％刻みで変化させたPOPCリポソームを調製し、蛍光プローブを導入することで蛍光寿命・蛍光偏光度測定に供した。
蛍光寿命測定によって観測されるC1P含有率に対する寿命の変化から、各類縁体のドメイン形成能を推定し、天然のC1Pと比較した。ヒドロキシ基を改変した類縁体では、ほぼ同程度のドメイン形成能を示したのに対し、アミド基をメチル化した類縁体では低下した。また、リン酸基のヒドロキシ基が1つのみの類縁体では、ドメイン形成能は低下した一方で、リン酸基がないものやメチル化した類縁体のドメイン形成能は上昇した。さらに、蛍光偏光度測定によって、温度上昇によるドメインの融解を測定した結果、ドメイン形成能が天然C1Pより低下した類縁体は熱安定性も低いことを示した。
これらの結果から、膜中でC1Pドメインを形成するには、C1Pの親水基構造が重要であり、特にアミド基とリン酸基の水素結合能が、C1P分子間相互作用に寄与すると考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
C1P類縁体の合成に成功し、蛍光測定によって類縁体の構造による膜中のC1Pドメインの物性の違いを明らかにすることができた。また、C1P-cPLA2α分子間相互作用解析に用いるタグ付きcPLA2αをヒト胚性腎臓(HEK293)細胞内で強制発現させ、抗タグ抗体を用いて単離精製して得る方法を確立した。現在までに測定で用いる化合物はほぼ手元に有していることになるので、次年度は表面プラズモン共鳴(SPR)や等温滴定熱測定(ITC)を集中的に行う。これらの測定によって、C1Pの構造と相互作用の強さの相関を明らかにし、C1PのcPLA2α認識部位を推定できると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
蛍光測定によるC1Pドメインの膜物性解析：前年度に引き続き、C1P類縁体を含む人工膜を調製し、cPLA2αや活性促進に重要な役割を果たしているカルシウムイオンの存在、非存在の条件で比較する。
C1P-cPLA2α分子間の相互作用解析：C1PのcPLA2αに対する親和性を定量的に求めるため、SPRとITCを行う。C1P類縁体を含む人工膜にcPLA2αが結合すると、結合量に相当する質量・熱量変化が生じるので、それに対応するシグナル変化を定量的に解析する。測定に必要な分析装置は学内で共有装置として使用できるので、まずは天然のC1P含有リポソームを用いて、各分析手法の最適条件の確立を行う。条件がそろえば、他の類縁体に対しても分析手法を適用する。これにより、C1Pの構造と相互作用の強さの相関を明らかにし、C1PのcPLA2α認識部位を推定する。さらに、前年度で解析したC1P類縁体の膜物性情報と合わせて、考察する。
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| Causes of Carryover |
当初、タンパク質を用いた相互作用解析のためのSPRやITC測定の試薬や消耗品の事前購入を予定していたが、消耗品には使用期限があること、実験実施は次年度であることを考慮した結果、その購入費が抑えられたため。また学会参加費、旅費は別の研究費からの支出になったため。
研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、研究を進めていく上で必要な試薬類や分析消耗品を購入し、当初予定通りの計画を実施していく。
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