2021 Fiscal Year Research-status Report
セラミド-1-リン酸の動的挙動解析に基づくホスホリパーゼA2分子認識機構の解明
| Project/Area Number |
19K15707
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
安田 智一 大阪大学, 理学研究科, 特任助教(常勤) (90771121)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | セラミド-1-リン酸 / 細胞質型ホスホリパーゼA2 / 蛍光寿命測定 / 表面プラズモン共鳴法 / 動的挙動解析 / 分子認識機構 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
細胞膜上に局所的に分布するセラミド-1-リン酸(C1P)は、どのようにして細胞質型ホスホリパーゼA2 (cPLA2) と特異的に結合するのか、その分子認識機構は未解明である。そこで、C1Pの集合状態 (ドメイン) に及ぼす特異的な動態変化が、cPLA2を分子認識するのに重要であるとの仮説を立てた。本研究では、生体モデル膜を用いて、C1P膜物性とC1P-cPLA2分子間の相互作用を観測し、その相関性を明らかにすることを目的とした。
本年度は、周辺の膜環境に応じて膜動態が異なるC1Pドメインを含むモデル膜を用いて、cPLA2との結合親和性に与える影響を調べるために表面プラズモン共鳴 (SPR) を測定した。まず、C1P含有膜の解離定数 (KD) は非含有膜に比べて小さい値を示したことから、C1PがcPLA2との親和性を高めていることが確認された。そして、各脂質組成のC1P含有・非含有膜の解離定数比を比較した結果、ドメイン形成能が低く、膜流動性の高いコレステロール含有膜では、基準としたPOPC膜よりも小さい値を示した。一方で、ドメイン形成能が高く、膜流動性の低いDOPC膜では大きい解離定数比を示した。したがって、C1Pドメイン形成能が高い膜環境であるほどcPLA2との結合親和性が高くなることが示された。昨年度明らかにしたC1P膜動態の結果と合わせると、cPLA2のC1P認識には、C1P周辺の脂質組成が与える膜動態およびC1Pの集合状態が重要な要因になると考えられる。
このように、本研究では、生体モデル膜において、C1Pの動態とcPLA2との相互作用を相補的に解析することによって、微量脂質として含まれる脂質メディエーターの機能にも膜動態が重要な役割を果たしていることを示すことができた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当該年度では、膜動態の異なるC1Pドメインを含むリポソームに対して、SPRによるcPLA2との相互作用解析を行った。その結果からcPLA2の分子認識には、C1Pドメインの膜動態が大きく寄与することが示唆された。しかしながら、当初予定していた、親水部の構造を改変したC1P類縁体を用いたcPLA2との相互作用解析にまで至らなかった。既にこれら類縁体の膜動態解析を終え、アミド基とリン酸基の水素結合能が、C1P分子間相互作用に寄与することが示された。そこで次年度は、C1P類縁体を含むリポソームに対して、SPRによるcPLA2との相互作用解析を行う。C1Pの分子構造に対するドメインの膜動態と相互作用の相関を明らかにすることで、cPLA2と結合するC1Pの親水部構造を原子レベルで同定できると考える。
|
| Strategy for Future Research Activity |
C1P類縁体が形成するドメインに対するcPLA2親和性を定量的に求めるため、SPRを行う。本年度に確立した測定の最適条件を適用し、構造改変した類縁体の中でも分子間の水素結合形成に大きく寄与する二重結合、アミド基とリン酸基に着目する。この測定で得られる相互作用情報と以前解析したC1Pの膜物性との相関からC1PのcPLA2認識部位を同定する。そして、本年度解析した周辺の膜環境が膜物性や相互作用に与える影響と合わせて考察することで、生体内でのC1P-cPLA2複合体の全体構造を明らかにする。また、膜動態が異なるC1Pドメインや類縁体で構成されるドメインを含むモデル膜を用いて、cPLA2によって遊離されるアラキドン酸を定量することで、膜動態や分子構造が与えるcPLA2活性への影響を評価することを目指す。これらによって、C1PがcPLA2と特異的に結合し、その活性を促進するための分子基盤を解明する。
|
| Causes of Carryover |
当該年度中に、類縁体とタンパク質の相互作用解析にまで至らなかったため、必要な試薬や消耗品の購入費が抑えられたため。また、学会参加費は別の研究費からの支出になったため。
脂質-タンパク質の分子認識機構解明の目的をより精緻に達成するために、類縁体とcPAL2との相互作用解析の実施に必要な試薬類や分析消耗品の購入や、成果発表の学会参加費や旅費、論文投稿の校閲費として使用し、当初予定通りの計画を実施していく。
|
